...10年后,角膜内皮细胞密度相当于60岁的老年人,将无法承受任何眼...
张有良 林珣珣 后晨蓉 牛星堂 唐庆
[摘要]目的：通过体外细胞学研究（共培养体系建立）直观表现脂肪干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）体外进血管形成能力，阐述脂肪干细胞作为辅助细胞通过促进早期血供建立而提高移植脂肪存活率的可能机制。方法：临床通过Coleman法抽吸成人大腿或腹部浅层脂肪，并通过经典方法培养获取ADSCs。对ADSCs进行形态学、表面分子标记物及多向分化等生物学特性鉴定，并通过Matrigel培养脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）管腔样结构形成实验探讨ADSCs体外促血管形成能力，说明ADSCs促进血管新生及移植物早期血供建立的潜力。结果：ADSCs/HUVECs共培养体系可于体外促进内皮细胞形成血管腔样结构，提高早期血管新生。结论：通过共培养体系模拟提示ADSCs体外具备促血管形成的能力，具有促进早期血供建立而提高移植物存活的潜力，为临床细胞辅助脂肪移植提高存活率的可能机制。
[关键词]脂肪移植；存活率；脂肪干细胞；血管形成；细胞共培养
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0105-04
A Vitro Study on Human Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells Promote the Vascularization of Endothelial Cell in Matrigel
ZHANG You-liang1，LIN Xun-xun1，HOU Chen-rong2，NIU Xing-tang1，TANG Qing1
（1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，Guangdong，China；2.Laser Center， Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou 510091，Guangdong，China）
Abstract： Objective To evaluate the angiogenesis potential of the adipose derived stem cells （ADSCs） in vitro in order to expound the possible mechanism about the ADSCs improved the survival rate of graft through promoting vascular remodeling in early stage. Methods The fat tissue was obtained from healthy adults abdomen or thigh liposuction through the Coleman technique. The ADSCs was obtained and cultured by the traditional method. The ADSCs was Identified by biological function properties studies including morphological characteristics， molecular surface marker expression and differentiation. The angiogenesis potential was testified by the tube formation assay system in Matrigel with Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in order to expound the angiogenesis potential for improving the survival rate of graft. Results ADSCs promoted the tube formation in vitro in the co-culture system in order to promote the angiogenesis in early stage. Conclusion By co-culture system， the ADSCs had the ability to promote angiogenesis. It had the potential that promote establishing the blood supply at early stage in vitro to improve the survival rate of graft， and that is the plausible mechanisms for cell assisted lipotransfer to improve the survival rate.
Key words：fat grafting； retention； adipose derived stem cells； angiogenesis； cells co-culture
自体脂肪移植广泛应用于整形修复外科[1-3]。然而脂肪移植物远期存活率低仍限制其临床应用效果。随着脂肪源性间充质干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）的发现[4]，其生物学特性具备提高移植物存活的潜力[5]。从此为基础衍生的细胞辅助脂肪移植技术（Cell-assisted lipotransfer， CAL）通过ADSCs与脂肪联合移植的模式，提高了移植脂肪的存活率[6-7]。脂肪分帶理论提示了早期血供建立是移植物存活的关键因素之一[8]，ADSCs是否能促进血管形成、建立血供而提高移植脂肪的存活率呢？本次通过ADSCs促进Matrigel体外脐静脉内皮细胞成血管实验，研究ADSCs体外促血管形成能力，探索ADSCs作为辅助细胞促进血管形成，提高移植脂肪存活率的可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料：本次选取健康男︰女（1：5），年龄17～34岁，从腹部或大腿部抽吸脂肪组织，研究已征本人同意，并自愿签署相关知情同意书。
1.2 试剂与仪器：I型胶原酶（Sigma，德国）、胰酶（Sigma，德国）、DMSO（Sigma，德国）、Trizol（Sigma，德国），D-Hanks溶液（Gibco，美国）、PBS（Gibco，美国）、FBS（Gibco，美国）、双抗（Gibco，美国）、DMEM培养液（Gibco，美国），内皮细胞培养液（ScienCell，美国）、内皮细胞生长因子复合物（ScienCell，美国）、Matrigel（ScienCell，美国）。培养板/培养瓶/冻存管/离心管（Corning，美国）、培养箱（Thermo，美国）、离心机（Thermo，美国）、超低温冰箱（Thermo，美国）、超净台（Thermo，美国）、光学/荧光显微镜（Leica，德国）、流式细胞仪（Beckman，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 传统方法分离培养ADSCs：抽吸所得离体脂肪组织静置20min，排尽下层液体，PBS洗涤1～2次，将脂肪组织按1：1.5倍体积加入0.1% I型胶原酶，置于37℃摇床震动消化50～60min。加入同体积DMEM终止消化。将消化后脂肪组织经1 500转/min离心10min。取管底沉淀细胞团，接种于25cm2培养瓶中，加入完全培养液常规有氧培养。48h后换液，去除未贴壁细胞。经传代培养后，进行形态学观察、表面标记物鉴定和三系分化等生物学特性检测。
1.3.2 人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）培养与传代：HUVECs原代细胞购于Sciencell公司，细胞鉴定可靠。HUVECs中加入内皮细胞生长因子（Endothelial Cell Growth Supplement，ECGs）的内皮细胞培养液（Endothelial Cell Medium，ECM）。
1.3.3 Matrigel培养下内皮细胞管腔形成实验
1.3.3.1 实验准备：①Matrigel保存于-20℃，经4℃过夜溶解呈液态，所有相关器械经-20℃降温，4℃预冷，Matrigel包被96孔板需于冰上完成：96孔板内每孔加入60μl 液态Matrigel包被，置于37℃孵化30min使Matrigel成胶；②取ADSCs（第3代）及HUVECs消化后1 100转/min，5min离心沉淀，分别取实验所需的培养液重悬，计数，调整细胞密度。
1.3.3.2 实验分组：共分为2组。①共培养组：在Matrigel包被96孔板内加入16 000个HUVECs，并加入4 000个ADSCs，使得HUVECs目标细胞群为4：1，加入200μl ECM（含1% FBS），于37℃温育；②阴性对照组：Matrigel包被96孔板加入20 000个HUVECs，加入200μl DMEM（含10% FBS）。每组分别设置3处复孔。
1.4 评价指标：96孔板温育16h后置于研究级倒置荧光显微镜下100倍数观察，对每孔随机选择视野拍照，有细胞视野入选实验结果。根据表1评分标准[9]评分。
表1 Matrigel培养下内皮细胞管腔形成实验评分标准 （分）
镜下表现 得分
无管腔芽生 0
细胞聚团，且有管腔芽生，无树枝样丛生 1
呈现树枝样丛生 2
相互连接的分支丛生 3
复杂的网状结构 4
1.5 统计学分析：使用SPSS统计学软件分析所获数据，以均数±标准差表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ADSCs鉴定结果：镜下可见细胞呈均一性不含脂滴长梭形细胞，经传代后形态均一，形态学观察上符合ADSCs特征，见图1。流式细胞仪检测提示：该细胞群符合ADSCs表面分子标记物表达特征，即CD34、CD45造血干细胞相关表面标记物均表达阴性，CD73、CD90、CD105分子表面标记物表达阳性，见图2。经成骨、成软骨、成脂三系诱导分化证实该细胞群具备三系分化能力，符合ADSCs细胞生物学特性，见图3。
注：A.ADSCs P3；B.ADSCs P5
图1 ADSCs形态学检观察结果，经传代培养，ADSCs呈均一的、不含脂滴的长梭形细胞群（标尺=100μm，200×）
2.2 Matrigel培养下内皮细胞管腔形成实验结果：①ADSCs/HUVECs共培养组大部分视野内可见岛状细胞聚团，部分视野可见细胞团伸出伪足样芽生结构，相邻细胞团通过芽生结构可交汇接合，少数视野可见完整管腔样结构，见图4；②DMEM阴性对照组可见HUVECs增殖缓慢，部分视野可见小范围聚团，未见任何成管芽生，无管腔结构形成，见图5。
将显微镜100倍数下拍摄的照片通过筛选（Matrigel包被曲面导致的图片聚焦不佳、细胞数过少或无细胞、液面或胶面气泡干扰拍摄等因素的图片剔除），最终每组均获得85份合格图片，根据评分标准，对图片进行评分，ADSCs/HUVECs共培养组得分为15分显著高于DMEM阴性对照组的0分，差异有统计学意义（P<0.05），95%置信区间为（0.82，2.75），表明ADSCs具备促HUVECs体外成管腔的能力，且其成血管能力显著优于DMEM单独培养，具備促血管新生早期建立血供提高移植物存活的潜力。
注：A.HUVECs增殖明显且呈岛状聚团，细胞团间可见芽生结构连接；B.围绕ADSCs呈聚团效应的HUVECs大量增殖，细胞团向外伸出的芽生样结构，模拟血管壁形成；C.a.细胞团之间伪足样芽生结构连接；b.多个芽生结构连接形成完整的管腔样结构
图4 ADSCs/HUVECs共培养组镜下成管效果检测图（标尺=100μm，100×）
3 讨论
研究表明间充质干细胞具备促进移植物存活的潜力，故ADSCs同样具备促进移植脂肪组织存活率的潜力[10-11]。在此基础上临床应用CAL技术可见移植脂肪存活率提高，但对于ADSCs促进脂肪移植存活率的实际机制仍未有明确证据及阐述。Kotaro Yoshimura等人的研究结果提示：移植脂肪组织的外周区域与受区内环境直接接触，可能具备建立早期血供的条件，故存活率较高。早期血供建立是移植物存活的关键因素之一。本课题组旨在证实ADSCs是否具备促进血管形成的潜力，探讨其通过促进早期血供建立而提高移植物存活率的可能机制。
本次实验运用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）建立细胞共培养体系，模拟体外ADSCs促进血管形成的能力，是检测ADSCs对血管新生作用的可靠实验方法[12-13]。通过HUVECs与ADSCs共同培养，观察HUVECs的变化和管腔样结构形成的情况，表现ADSCs对HUVECs的成血管作用，探索ADSCs作为辅助细胞提高脂肪组织存活率的潜在能力，也真实模拟了临床上应用基质血管成分（Stromal vascular fraction， SVF）辅助脂肪移植中ADSCs对移植物存活的作用。管腔形成实验（Tube formation assay，TFA）结果提示ADSCs可以通过共培养体系诱导内皮细胞激活、增殖和迁移，促进管腔样结构形成，其可能机制为ADSCs旁分泌血管形成相关生长因子而达成的[14]。在如TGF-β、VEGF及FGF等多种生长因子的作用下，内皮细胞出现大量增殖并相互连接。由于ADSCs较强的耐缺氧能力，这些效应在早期是持续存在的。另一方面，鑒于间充质干细胞的一些细胞学特性，ADSCs对于内皮细胞的影响表现在很多方面，体现在ADSCs和HUVECs共培养体系中则是内皮细胞增殖、迁移后围绕ADSCs为中心聚团分布。细胞聚团现象使HUVECs细胞间隙缩短，间隙中生成的伪足样芽生结构难以观察，对管腔样结构的形成造成了一定程度上的干扰。实际上在聚团的细胞间广泛分布着网格状的芽生样结构，且在显微镜视野下发现细胞团之间存在稳定结合的芽生结构，甚至部分视野可以发现多个细胞团间形成密闭完整的管腔样结构。而在Metrigel孵育时间的选择中，考虑脂肪细胞的耐缺氧能力较差[15]，早期缺血缺氧是造成脂肪组织坏死、存活率较低的重要原因之一，早期血管新生血供建立可能是脂肪组织存活的关键条件。通过16h的短时程孵育进行观察对比，探讨了ADSCs对成血管过程和早期血供建立的实际作用。该实验细胞共培养体系与临床上CAL的情况较为相似：混合了ADSCs的脂肪组织移植后因ADSCs散在分布于受区，可能发挥促进血管管腔样结构形成的作用，而广泛形成的血管管腔样结构可能是早期局部微血管重建的基础。微血管重建到早期血供建立的转变，表明ADSCs的应用可以提供适合早期血供建立的基础条件。而阴性对照组即添加10% FBS的DMEM培养组，HUVECs未见明显细胞增殖，无细胞聚团现象，所有视野均无管腔结构形成，且未见任何细胞伸出伪足样芽生结构，可定义为体外无成管结果。这种无其他因素的培养体系内HUVECs体外成管实验所获得的阴性结果与其他类似研究的结果相符[16]。这也充分说明内皮细胞在无相关刺激和内环境基础下不能形成管腔样结构，更不能过渡至早期血管重建。这也可能是脂肪移植早期血供缺乏、缺氧所导致存活率较低的原因。综上所述，ADSCs在体外作用于HUVECs并促进管腔样结构的生成，即具备促进血管新生重建的功能。这也是ADSCs作为辅助细胞在CAL中促进早期血供建立、提高移植脂肪存活率的可能关键机制之一。
CAL是脂肪组织和辅助细胞联合注射的手术方式，ADSCs对移植的脂肪组织的影响不能通过单一途径阐述。ADSCs自身分化成脂[5]、协同作用、抗氧化[17]等作用途径都可能影响移植物的存活率。体外内皮细胞血管形成实验与CAL体内内环境条件仍存在一定的差异，仍需要通过动物模型实验进一步证实。此次实验结果可作为理论基础，通过建立合适的动物模型，模拟体内ADSCs对脂肪组织早期血供建立的影响，通过移植脂肪存活率测量进一步阐明ADSCs在CAL中的实际作用。
[参考文献]
[1]Coleman SR，Katzel EB.Fat Grafting for Facial Filling and Regeneration[J].Clin Plast Surg，2015，42（3）：289-300.
[2]Coleman SR，Saboeiro AP.Primary Breast Augmentation with Fat Grafting[J].Clin Plast Surg，2015，42（3）：301-306.
[3]Strong AL，Cederna PS，Rubin JP，et al.The Current State of Fat Grafting： A Review of Harvesting， Processing， and Injection Techniques[J].Plast Reconstr Surg，2015，136（4）：897-912.
[4]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage Cells from Human Adipose Tissue： Implications for Cell-Based Therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：211-228.
[5]Tsuji W，Inamoto T，Yamashiro H，et al.Adipogenesis Induced by Human Adipose Tissue–Derived Stem Cells[J].Tissue Eng Part A，2009，15（1）：83-93.
[6]Domenis R，Lazzaro L，Calabrese S，et al.Adipose tissue derived stem cells： in vitro and in vivo analysis of a standard and three commercially available cell-assisted lipotransfer techniques[J].Stem Cell Res Ther，2015，6（1）：1-15.
[7]Centurion P.Studies in Fat Grafting： Part V. Cell-Assisted Lipotransfer to Enhance Fat Graft Retention Is Dose Dependent[J].Plast Reconstr Surg，2015，136（6）：849e-850e.
[8]Eto H，Kato H，Suga H，et al.The fate of adipocytes after nonvascularized fat grafting： evidence of early death and replacement of adipocytes[J].Plast Reconstr Surg，2012，129（5）：1081-1092.
[9]Mohammadi E，Nassiri SM，Rahbarghazi R，et al.Endothelial juxtaposition of distinct adult stem cells activates angiogenesis signaling molecules in endothelial cells[J].Cell Tissue Res，2015，362（3）：597-609.
[10]Bhang SH，Lee S，Shin JY，et al.Transplantation of cord blood mesenchymal stem cells as spheroids enhances vascularization[J].Tissue Eng Part A，2012，18（19-20）：2138-2147.
[11]Deng M，Gu Y，Liu Z，et al.Endothelial Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells on Polyglycolic Acid/Polylactic Acid Mesh[J].Stem Cells Int，2015，7：1-11.
[12]Thangarajah H，Vial IN，Chang E，et al.IFATS collection： Adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia[J].Stem Cells，2009，27（1）：266-274.
[13]Holnthoner W，Hohenegger K，Husa AM，et al.Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix[J].J Tissue Eng Regen Med，2015，9（2）：127-136.
[14]Rehman J，Traktuev D，Li J，et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J].Circulation，
2004，109（10）：1292-1298.
[15]Suga H，Eto H，Aoi N，et al.Adipose Tissue Remodeling under Ischemia： Death of Adipocytes and Activation of Stem/Progenitor Cells[J].Plast Reconstr Surg，2010，126（6）：1911-1923.
[16]Strassburg S，Nienhueser H，Stark GB，et al.Human adipose-derived stem cells enhance the angiogenic potential of endothelial progenitor cells， but not of human umbilical vein endothelial cells[J].Tissue Eng Part A，2013，19（1-2）：166-174.
[17]Gimble JM，Katz AJ，Bunnell BA.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circ Res，2007，100（9）：1249-1260.
