响应面法优化沙棘果油提取工艺的研究
崔春利+王蓓+邓翀+等
摘要：目的 以多成分综合评分结合响应面法筛选熟大黄的最佳炮制工艺。方法 以没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚7种成分的综合评分为指标，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计，考察加酒量、闷润时间、蒸制时间因素对熟大黄炮制工艺的影响，筛选最佳炮制工艺参数。结果 采用Design Expert 8.05软件对数据进行分析，建立7种成分含量的综合评分与考察因素多元二次回归方程数学模型，预测熟大黄最佳炮制条件为每100 g药材加酒量36.6 mL，闷润时间2.16 h，蒸制时间10.96 h。结合生产实际，将工艺修正为每100 g药材加酒量35 mL，闷润时间2 h，蒸制时间11 h。结论 优选的炮制工艺能合理控制熟大黄炮制质量，为制定其饮片的质量标准和临床应用提供了依据。
关键词：熟大黄；炮制工艺；Box-Behnken试验设计
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.028
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0098-05
大黄为蓼科掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，其味苦、性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功
基金项目：陕西省教育厅重点实验室项目（13JS030）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201210716002）
效[1]。临床常用饮片为生大黄、酒大黄、熟大黄、醋大黄和大黄炭[2]。2010年版《中华人民共和国药典》除有生大黄质量标准外，其他大黄炮制品尚缺乏较为统一的炮制方法、炮制工艺和质量标准。大黄不同的炮制品，因炮制温度、加热时间、所用辅料不同，其化学成分有所不同，药效亦发生变化，从而影响其临床用药的准确性和有效性[3]。熟大黄泻下作用弱，而活血化瘀和泻火解毒功效增强，其炮制工艺研究较少，临床所用饮片缺乏规范性。基于此，本试验拟以多成分含量为评价指标，采用Box-Benhnken试验设计，优选大黄酒蒸工艺参数，旨在为熟大黄饮片质量标准的建立及临床准确合理用药提供参考。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（L-2130二元泵，L-2400检测器，日本日立公司），ISO9001型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
大黄购于万寿路药材市场，经陕西中医学院王继涛高级实验师鉴定为药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎；没食子酸（批号100831- 200302）、大黄素（批号110756-200709）、大黄酚（批号110796-200615）对照品购自中国药品生物制品检定所，大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷（批号042012）、大黄酸（批号03121210）、大黄素甲醚（批号02201205）、芦荟大黄素（批号03071201）对照品购自天津西玛科技有限公司，对照品纯度均>98%；黄酒（绍兴县第三酒厂，20131216）；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水过滤使用，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取干燥至恒重的没食子酸、大黄酚- 8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品10.30、5.00、10.01、10.01、10.00、10.30、2.52 mg，置于25、25、25、100、25、50、25 mL容量瓶中，以适当溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.412 0、0.200 0、0.400 4、0.100 1、0.400 0、0.206 0、0.100 8 mg/mL的对照品溶液。根据供试品溶液中所选色谱峰峰面积，按适当比例混合对照品溶液，得没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度分别为0.103 0、0.1500、0.0206、0.0253、0.0400、0.0657、0.0403 mg/mL的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取大黄生品100 g，按照不同炮制工艺参数进行炮制。精密称取大黄炮制样品粉末（60目筛）约2 g，用11倍量80%乙醇提取3次，每次66 min，滤过，提取液在80 ℃水浴浓缩，挥干溶媒，以80%乙醇溶解，定容于25 mL量瓶中。储存于4 ℃，冷藏待用。
2.3 方法学考察
2.3.1 色谱条件 依利特ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（B）-水（0.2%甲酸），梯度洗脱（0～10 min，5%～15%B；10～20 min，15%～30%B；20～31 min，30%～42%B；31～40 min，42%～47%B；40～46 min，47%～53%B；46～66 min，53%～68%B；66～75 min，68%～100%B；75～85 min，100%～100%B），流速0.8 mL/min，检测波长260 nm，进样量10 μL。色谱。
2.3.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样5次，记录峰面积，结果没食子酸、大黄酚- 8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.32%、1.68%、1.71%、1.45%、1.84%、1.89%、1.54%，表明精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.3.1”项色谱条件下，于0、2、4、8、12、16、24 h进样分析，记录峰面积，结果没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD均<3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.5 重复性试验 精密称取熟大黄样品粉末5份，每份约0.5 g，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样分析，记录相同保留时间峰面积，结果没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD依次为1.22%、0.98%、1.64%、1.51%、1.96%、1.73%、1.14%，表明本法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取熟大黄样品粉末，共6份（没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄酚回收率考察中药材取样量为0.1 g，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚回收率考察药材取样量为0.5 g），加入相应对照品，按照供试品溶液处理方法制备，按“2.3.1”项下色谱条件平行测定6份样本，计算加样回收率。2.3.7 含量测定方法 精密称取熟大黄样品粉末，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样，按外标法以峰面积计算样品中没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
2.4 炮制工艺研究方案
2.5 数据分析
以熟大黄7种成分综合评分为考察指标，由于其药效贡献值大小未知，因此设定总值为1，每种成分的药效贡献值各占1/7[4]，采用加权综合评分法计算7种化学成分在炮制样品的综合评分值。
3 结果
3.1 熟大黄工艺综合评分回归模型的建立
Box-Behnken试验设计方案和各指纹图谱的共有色谱峰的综合评分数据见表4。将表4中各组综合评分数据采用Design Expert8.05软件进行多元回归和二项式分析，建立熟大黄炮制工艺综合评分对3个因素的二次回归模型方程：Y=82.67+3.02A+4.93B+4.74C+2.93AB+5.59AC-0.49BC-0.36A2-5.18B2-1.97C2。
（P=0.037 9），表明试验结果误差较小，模型拟合合理。方差分析结果显著分别是一次项B和C、交互项AC、二次项B2，表明各考察因素对综合评分的影响不仅是线性关系，还存在交互综合影响。模型的相关系数平方为0.840 8，表明该模型能反映熟大黄7种化学成分谱综合评分与加酒量、闷润时间和蒸制时间的关系，可以用该回归方程对熟大黄炮制工艺参数进行分析与预测。不同考察因素与综合评分的响应面分析见
3.3 最佳工艺条件预测与试验验证
通过回归模型的分析，得到熟大黄最佳炮制工艺为加酒量36.6 mL，闷润时间2.16 h，蒸制时间10.96 h。结合生产实际需要，将此工艺参数最终修订为加酒量35 mL，闷润时间2 h，蒸制时间11 h。采用上述工艺参数进行3次平行试验，熟大黄中7种成分的综合评皆在腹部，且足太阴脾经、足阳明胃经、足少阴肾经皆循行于腹部，肺脏经气亦起于腹部中焦。可见与消渴相关的脏腑均与中、下焦有密切联系。消渴病机乃阴虚为本、燥热为标。正常情况下，肺脏通调水道、脾脏主运化为胃行其津液、肾主水而藏精，三脏的生理功能需要三焦的作用贯穿始终，才能完成津液水分的输布、疏通和排泄的全过程。若阴伤肺燥，则津液失于敷布，久而脾胃失濡、肾阴失润；若胃阴亏耗、脾阴不足，津液则无所生，上灼肺液、下耗肾阴；若肾阴亏虚则虚火内生，连及肺脾；若三焦失司，则调节水液及气化功能紊乱而成消渴之疾。可见，消渴与三焦的部位及生理功能以及腹部均有着密切关系。
本研究取腹部腧穴治疗2型糖尿病，中脘、下脘可同调上、中二焦，气海、关元可共理中、下二焦，培肾固本。滑肉门、外陵可调理气机升降。同时，根据三消不同症状配以阴都、肓俞、气穴。如出现心烦引饮、口干口苦等上消症状，取阴都调和心肾，水火既济。中消多因虚火浊伤中焦脾胃，胃受纳之功紊乱，脾炼精之力减弱，导致消谷善饥、痰浊内生，取肓俞穴，意在调理肾之阴精，消导脾胃之虚火。下消症状主因肾精亏耗，下焦不固，膀胱排泄无权，故见小便频数，取气穴以增强补益肾精、调理脏腑、固摄膀胱之用。这3个配穴均为肾经腧穴，意在滋养肾阴，补原气之根；冲脉与肾经并行而上，冲脉为血海且为十二经之海，取肾经穴位亦可调理足三阴经经气。
本观察结果表明，基于三焦理论的腹部取穴治疗糖尿病，在控制血糖、降低HBA1c水平及减轻患者临床症状上明显优于对照组。此针法丰富了2型糖尿病的治疗手段，值得进一步探讨。
参考文献：
[1] Wang Liping， Zhang Honglin. Discussion on the mechanisms of BOs abdominal acupuncture therapy[J]. World Journal of Acupuncture- Moxibustion，2013，23（4）：52-59.
[2] 《中国糖尿病防治指南》编写组.中国糖尿病防治指南[M].北京：北京大学医学出版社，2004：24-25.
[3] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[S].北京：中国医药科技出版社，2002：233-236.
（收稿日期：2014-04-07；编辑：季巍巍）
3.2 方程显著性检验
2.3.5 重复性试验 精密称取熟大黄样品粉末5份，每份约0.5 g，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样分析，记录相同保留时间峰面积，结果没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD依次为1.22%、0.98%、1.64%、1.51%、1.96%、1.73%、1.14%，表明本法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取熟大黄样品粉末，共6份（没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄酚回收率考察中药材取样量为0.1 g，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚回收率考察药材取样量为0.5 g），加入相应对照品，按照供试品溶液处理方法制备，按“2.3.1”项下色谱条件平行测定6份样本，计算加样回收率。2.3.7 含量测定方法 精密称取熟大黄样品粉末，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样，按外标法以峰面积计算样品中没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
2.4 炮制工艺研究方案
2.5 数据分析
以熟大黄7种成分综合评分为考察指标，由于其药效贡献值大小未知，因此设定总值为1，每种成分的药效贡献值各占1/7[4]，采用加权综合评分法计算7种化学成分在炮制样品的综合评分值。
3 结果
3.1 熟大黄工艺综合评分回归模型的建立
Box-Behnken试验设计方案和各指纹图谱的共有色谱峰的综合评分数据见表4。将表4中各组综合评分数据采用Design Expert8.05软件进行多元回归和二项式分析，建立熟大黄炮制工艺综合评分对3个因素的二次回归模型方程：Y=82.67+3.02A+4.93B+4.74C+2.93AB+5.59AC-0.49BC-0.36A2-5.18B2-1.97C2。
（P=0.037 9），表明试验结果误差较小，模型拟合合理。方差分析结果显著分别是一次项B和C、交互项AC、二次项B2，表明各考察因素对综合评分的影响不仅是线性关系，还存在交互综合影响。模型的相关系数平方为0.840 8，表明该模型能反映熟大黄7种化学成分谱综合评分与加酒量、闷润时间和蒸制时间的关系，可以用该回归方程对熟大黄炮制工艺参数进行分析与预测。不同考察因素与综合评分的响应面分析见
3.3 最佳工艺条件预测与试验验证
通过回归模型的分析，得到熟大黄最佳炮制工艺为加酒量36.6 mL，闷润时间2.16 h，蒸制时间10.96 h。结合生产实际需要，将此工艺参数最终修订为加酒量35 mL，闷润时间2 h，蒸制时间11 h。采用上述工艺参数进行3次平行试验，熟大黄中7种成分的综合评皆在腹部，且足太阴脾经、足阳明胃经、足少阴肾经皆循行于腹部，肺脏经气亦起于腹部中焦。可见与消渴相关的脏腑均与中、下焦有密切联系。消渴病机乃阴虚为本、燥热为标。正常情况下，肺脏通调水道、脾脏主运化为胃行其津液、肾主水而藏精，三脏的生理功能需要三焦的作用贯穿始终，才能完成津液水分的输布、疏通和排泄的全过程。若阴伤肺燥，则津液失于敷布，久而脾胃失濡、肾阴失润；若胃阴亏耗、脾阴不足，津液则无所生，上灼肺液、下耗肾阴；若肾阴亏虚则虚火内生，连及肺脾；若三焦失司，则调节水液及气化功能紊乱而成消渴之疾。可见，消渴与三焦的部位及生理功能以及腹部均有着密切关系。
本研究取腹部腧穴治疗2型糖尿病，中脘、下脘可同调上、中二焦，气海、关元可共理中、下二焦，培肾固本。滑肉门、外陵可调理气机升降。同时，根据三消不同症状配以阴都、肓俞、气穴。如出现心烦引饮、口干口苦等上消症状，取阴都调和心肾，水火既济。中消多因虚火浊伤中焦脾胃，胃受纳之功紊乱，脾炼精之力减弱，导致消谷善饥、痰浊内生，取肓俞穴，意在调理肾之阴精，消导脾胃之虚火。下消症状主因肾精亏耗，下焦不固，膀胱排泄无权，故见小便频数，取气穴以增强补益肾精、调理脏腑、固摄膀胱之用。这3个配穴均为肾经腧穴，意在滋养肾阴，补原气之根；冲脉与肾经并行而上，冲脉为血海且为十二经之海，取肾经穴位亦可调理足三阴经经气。
本观察结果表明，基于三焦理论的腹部取穴治疗糖尿病，在控制血糖、降低HBA1c水平及减轻患者临床症状上明显优于对照组。此针法丰富了2型糖尿病的治疗手段，值得进一步探讨。
参考文献：
[1] Wang Liping， Zhang Honglin. Discussion on the mechanisms of BOs abdominal acupuncture therapy[J]. World Journal of Acupuncture- Moxibustion，2013，23（4）：52-59.
[2] 《中国糖尿病防治指南》编写组.中国糖尿病防治指南[M].北京：北京大学医学出版社，2004：24-25.
[3] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[S].北京：中国医药科技出版社，2002：233-236.
（收稿日期：2014-04-07；编辑：季巍巍）
3.2 方程显著性检验
2.3.5 重复性试验 精密称取熟大黄样品粉末5份，每份约0.5 g，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样分析，记录相同保留时间峰面积，结果没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD依次为1.22%、0.98%、1.64%、1.51%、1.96%、1.73%、1.14%，表明本法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取熟大黄样品粉末，共6份（没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄酚回收率考察中药材取样量为0.1 g，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚回收率考察药材取样量为0.5 g），加入相应对照品，按照供试品溶液处理方法制备，按“2.3.1”项下色谱条件平行测定6份样本，计算加样回收率。2.3.7 含量测定方法 精密称取熟大黄样品粉末，按“2.2”项下方法制备，在“2.3.1”项色谱条件下进样，按外标法以峰面积计算样品中没食子酸、大黄酚-8-O-β-D葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
2.4 炮制工艺研究方案
2.5 数据分析
以熟大黄7种成分综合评分为考察指标，由于其药效贡献值大小未知，因此设定总值为1，每种成分的药效贡献值各占1/7[4]，采用加权综合评分法计算7种化学成分在炮制样品的综合评分值。
3 结果
3.1 熟大黄工艺综合评分回归模型的建立
Box-Behnken试验设计方案和各指纹图谱的共有色谱峰的综合评分数据见表4。将表4中各组综合评分数据采用Design Expert8.05软件进行多元回归和二项式分析，建立熟大黄炮制工艺综合评分对3个因素的二次回归模型方程：Y=82.67+3.02A+4.93B+4.74C+2.93AB+5.59AC-0.49BC-0.36A2-5.18B2-1.97C2。
（P=0.037 9），表明试验结果误差较小，模型拟合合理。方差分析结果显著分别是一次项B和C、交互项AC、二次项B2，表明各考察因素对综合评分的影响不仅是线性关系，还存在交互综合影响。模型的相关系数平方为0.840 8，表明该模型能反映熟大黄7种化学成分谱综合评分与加酒量、闷润时间和蒸制时间的关系，可以用该回归方程对熟大黄炮制工艺参数进行分析与预测。不同考察因素与综合评分的响应面分析见
3.3 最佳工艺条件预测与试验验证
通过回归模型的分析，得到熟大黄最佳炮制工艺为加酒量36.6 mL，闷润时间2.16 h，蒸制时间10.96 h。结合生产实际需要，将此工艺参数最终修订为加酒量35 mL，闷润时间2 h，蒸制时间11 h。采用上述工艺参数进行3次平行试验，熟大黄中7种成分的综合评皆在腹部，且足太阴脾经、足阳明胃经、足少阴肾经皆循行于腹部，肺脏经气亦起于腹部中焦。可见与消渴相关的脏腑均与中、下焦有密切联系。消渴病机乃阴虚为本、燥热为标。正常情况下，肺脏通调水道、脾脏主运化为胃行其津液、肾主水而藏精，三脏的生理功能需要三焦的作用贯穿始终，才能完成津液水分的输布、疏通和排泄的全过程。若阴伤肺燥，则津液失于敷布，久而脾胃失濡、肾阴失润；若胃阴亏耗、脾阴不足，津液则无所生，上灼肺液、下耗肾阴；若肾阴亏虚则虚火内生，连及肺脾；若三焦失司，则调节水液及气化功能紊乱而成消渴之疾。可见，消渴与三焦的部位及生理功能以及腹部均有着密切关系。
本研究取腹部腧穴治疗2型糖尿病，中脘、下脘可同调上、中二焦，气海、关元可共理中、下二焦，培肾固本。滑肉门、外陵可调理气机升降。同时，根据三消不同症状配以阴都、肓俞、气穴。如出现心烦引饮、口干口苦等上消症状，取阴都调和心肾，水火既济。中消多因虚火浊伤中焦脾胃，胃受纳之功紊乱，脾炼精之力减弱，导致消谷善饥、痰浊内生，取肓俞穴，意在调理肾之阴精，消导脾胃之虚火。下消症状主因肾精亏耗，下焦不固，膀胱排泄无权，故见小便频数，取气穴以增强补益肾精、调理脏腑、固摄膀胱之用。这3个配穴均为肾经腧穴，意在滋养肾阴，补原气之根；冲脉与肾经并行而上，冲脉为血海且为十二经之海，取肾经穴位亦可调理足三阴经经气。
本观察结果表明，基于三焦理论的腹部取穴治疗糖尿病，在控制血糖、降低HBA1c水平及减轻患者临床症状上明显优于对照组。此针法丰富了2型糖尿病的治疗手段，值得进一步探讨。
参考文献：
[1] Wang Liping， Zhang Honglin. Discussion on the mechanisms of BOs abdominal acupuncture therapy[J]. World Journal of Acupuncture- Moxibustion，2013，23（4）：52-59.
[2] 《中国糖尿病防治指南》编写组.中国糖尿病防治指南[M].北京：北京大学医学出版社，2004：24-25.
[3] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[S].北京：中国医药科技出版社，2002：233-236.
（收稿日期：2014-04-07；编辑：季巍巍）
3.2 方程显著性检验
