不同采收期连翘金钟花果实中连翘酯苷和连翘苷的含量测定.pdf
郑江萍+叶正德+梁俊+黄良永
摘要：目的 比较连翘药材及其配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量。方法 采用高效液相色谱梯度洗脱法。色谱柱：SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 ? m）；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%冰醋酸溶液；流速：1.0 mL/min；检测波长：277 nm；柱温：30 ℃。对连翘药材及其配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量进行测定，比较二者含量的差异。结果 连翘配方颗粒中连翘酯苷A的含量低于原药材中的含量，与所标示的浓缩倍数不符；配方颗粒中连翘苷的含量与原药材一致。结论 原配方颗粒的生产工艺需要改进，配方颗粒需要建立完善的质量控制方法和合理的质量标准。
关键词：连翘；配方颗粒；连翘酯苷A；连翘苷；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.027
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）11-0088-04
连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，用于痈疽、瘰疬、乳痛、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等[1]。连翘属植物化学成分多样，目前已从连翘属植物中分离出150个化合物，其中苯乙醇苷类20个、木脂素类32个、黄酮类12个、萜类20个、C6～C2天然醇类17个，还有生物碱类、甾醇类、苯甲醇类、苯丙烯苷类、神经酰胺类、挥发油及其他成分。其中，以连翘酯苷A和连翘苷2种活性成分的含量最高。连翘酯苷A对认知障碍及短暂性脑缺血有神经保护作用，具有改善学习记忆障碍、舒张血管、抗氧化、抗菌、抗感染、解热、抗DNA损伤、防护耳毒性等广泛的药理作用[2-4]。连翘配方颗粒以连翘药材为原料，经水提取、浓缩、喷雾干燥而制成的颗粒，临床供配方用。目前，对于连翘配方颗粒是否具有与连翘药材等同的药效以及能否取代药材用于配方，具有较大的争议。本研究以连翘酯苷A和连翘苷为指标成分，采用高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱方法，测定连翘药材及其配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量，比较二者含量的差异，为连翘配方颗粒的生产和使用提供试验依据。
1 仪器与试药
DIONEX Ultimate3000高效液相色谱仪（低压四元梯度泵、自动进样器、多波长紫外检测器、柱温箱）， 美国赛默飞公司；变色龙色谱工作站（v6.8），美国赛默飞公司；SunFire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Waters；TP150超声清洗机，北京天鹏科技公司；GWA-10超纯水机，北京普析通用；AUW120D电子天平（十万分之一），日本岛津；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
连翘酯苷A对照品（批号111810-201304，94.3%）、连翘苷对照品（批号110821-200711，98.9%）均由中国食品药品检定研究院提供。连翘药材（批号120701、130112、130824）由广东广州某医药股份公司提供，为该厂生产配方颗粒的原药材，经湖北医药学院药学院黄良永副教授鉴定，均为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的干燥果实（老翘）；连翘配方颗粒（广东广州某医药股份公司，批号1302002S、1307003S、1311001S，1 g相当于连翘药材10 g）。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取连翘酯苷A对照品21.4 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得807.208 μg/mL的连翘酯苷A对照品储备液；精密称取连翘苷对照品20.6 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得407.468 μg/mL的连翘苷对照品储备液。再分别精密量取连翘酯苷A和连翘苷对照品储备液5.0、0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得每1 mL含连翘酯苷A 403.604 μg、连翘苷20.373 4 μg的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取连翘药材粉末（过5号筛）约0.5 g（配方颗粒研成细粉，精密称取约0.05 g），置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱：SunFire C18（4.6 mm×250 ㎜，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.4%冰醋酸溶液，按表1程序进行梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：277 nm；进样量：10 μL[1]。结果在样品色谱图中连翘酯苷A峰、连翘苷峰和相邻的杂质峰分离好，无干扰。色谱图见图1。
2.4 线性关系考察
精密量取连翘酯苷A对照品储备液1、2、5、7.5、10 mL，分别用甲醇稀释至10 mL，在“2.3”项色谱条件下进样10 μL测定；精密量取连翘苷对照品储备液0.1、0.2、0.5、1、2 mL，用甲醇分别稀释成10 mL，在“2.3”项色谱条件下进样10 μL测定。以峰面积积分值为纵坐标，连翘酯苷A和连翘苷进样质量为横坐标，进行线性回归。结果连翘酯苷A和连翘苷进样质量分别在0.807 2～8.072 μg和0.040 75～0.814 9 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，回归方程分别为连翘酯苷A S=0.130 8C+0.454 1（r=0.999 5，n=5）， 连翘苷S=0.108 2C+0.014 4（r=0.999 9，n=5）。
2.5 精密度试验
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，重复进样5次测定，结果连翘酯苷A和连翘苷峰面积积分值的RSD分别为0.63%、0.15%，表明测定方法的精密度好。
2.6 重复性试验
取连翘药材和配方颗粒，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液并测定连翘酯苷A和连翘苷的色谱峰面积，结果连翘酯苷峰面积的RSD分别为1.82%、1.51%，连翘苷峰面积的RSD分别为0.53%、0.37%，表明测定方法的重复性符合要求。
2.7 稳定性试验
取连翘药材粉末，制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0、6、12、24 h各进样10 μL，测定连翘酯苷A和连翘苷的峰面积，结果RSD分别为0.91%、0.66%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的连翘药材粉末0.25 g（批号120701）和配方颗粒粉末0.025 g（批号1311001S）各6份，精密称定，分别精密加入连翘酯苷A和连翘苷对照品储备液3.5、1 mL，按样品测定方法，分别测定连翘药材及其配方颗粒中2种成分的回收率。结果连翘酯苷A的平均加样回收率分别为97.30%（RSD=1.02%）、97.38%（RSD=0.96%），连翘苷分别为99.13（RSD=0.58%）、99.20%（RSD=0.49%），见表2。
2.9 样品含量测定
精密称取连翘药材粉末0.5 g和配方颗粒的粉末0.05 g，按“2.2”项下方法制备样品溶液，取样品溶液和“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，用外标法计算连翘酯苷A和连翘苷的含量，结果见表3。
3 讨论
2010年《中华人民共和国药典》采用2个流动相系统分别测定连翘酯苷A和连翘苷的含量，操作步骤多；本试验采用乙腈和0.4%冰醋酸溶液作为流动相，进行梯度洗脱，同时测定两成分的含量，色谱条件的适用性好，杂质无干扰，操作简单，回收率高。在选择检测波长时，连翘酯苷A的最大吸收波长为330 nm，而连翘苷的最大吸收波长为277 nm，经过试验，在230、254、270、277、284、330 nm试验波长中，277 nm波长处两成分的检测灵敏度均较高，故选择277 nm作为检测波长。
由样品含量测定结果可知，配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量以干燥品计算（配方颗粒水分平均为2.4%，药材水分平均为4.3%），二者含量按原药材换算均达到药典要求（含连翘酯苷A含量不低于0.25%，连翘苷含量不低于0.15%）[1]，但是配方颗粒中连翘酯苷A的含量与标示的浓缩倍数（相当于原药材10倍）不相符，只有原药材含量的84.3%。
连翘配方颗粒生产工艺是以水为溶媒，经水提取、浓缩、喷雾干燥制成。连翘中以连翘酯苷A为代表的脂溶性成分，以水提，从药材到配方颗粒，转移率偏低，若要提高配方颗粒中连翘酯苷A的含量，必须改进配方颗粒的生产工艺。文献报道，选择不同浓度的乙醇溶液代替水作为提取溶剂，既能兼顾工业化大规模生产，又能最大限度地提高连翘酯苷A和连翘苷的提取率[5-7]。
中药配方颗粒在我国已经使用多年，由于配方灵活，患者服用方便，深受医生和患者的欢迎。但目前尚无统一的质量控制标准，质量参差不齐，所以尽快建立配方颗粒的质量控制方法和合理的质量标准，对于提高配方颗粒的质量、确保临床疗效具有非常重要的意义。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159.
[2] 陈玲，李晓，李倩，等.连翘属植物化学成分的研究进展[J].现代药物与临床，2013，28（3）：441-445.
[3] 孟祥乐，李俊平，李丹，等.连翘的化学成分及其药理活性研究进展[J].中国药房，2010，21（43）：4117-4118.
[4] 吴国友.连翘药理作用研究进展[J].中医学报，2013，28（10）：1508- 1509.
[5] 黄桂丽，王彩云.连翘提取工艺研究[J].吉林医学院学报，2008，29（6）：322-324.
[6] 王进东，张应伟.正交法优选连翘酯苷最佳提取工艺[J].山西中医， 2008，29（8）：48-49.
[7] 靖会，李教社，杨银京.正交试验法优选连翘叶中连翘酯苷A的提取工艺[J].中国药业，2011，20（15）：39-41.
（收稿日期：2014-03-24；编辑：陈静）
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，重复进样5次测定，结果连翘酯苷A和连翘苷峰面积积分值的RSD分别为0.63%、0.15%，表明测定方法的精密度好。
2.6 重复性试验
取连翘药材和配方颗粒，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液并测定连翘酯苷A和连翘苷的色谱峰面积，结果连翘酯苷峰面积的RSD分别为1.82%、1.51%，连翘苷峰面积的RSD分别为0.53%、0.37%，表明测定方法的重复性符合要求。
2.7 稳定性试验
取连翘药材粉末，制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0、6、12、24 h各进样10 μL，测定连翘酯苷A和连翘苷的峰面积，结果RSD分别为0.91%、0.66%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的连翘药材粉末0.25 g（批号120701）和配方颗粒粉末0.025 g（批号1311001S）各6份，精密称定，分别精密加入连翘酯苷A和连翘苷对照品储备液3.5、1 mL，按样品测定方法，分别测定连翘药材及其配方颗粒中2种成分的回收率。结果连翘酯苷A的平均加样回收率分别为97.30%（RSD=1.02%）、97.38%（RSD=0.96%），连翘苷分别为99.13（RSD=0.58%）、99.20%（RSD=0.49%），见表2。
2.9 样品含量测定
精密称取连翘药材粉末0.5 g和配方颗粒的粉末0.05 g，按“2.2”项下方法制备样品溶液，取样品溶液和“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，用外标法计算连翘酯苷A和连翘苷的含量，结果见表3。
3 讨论
2010年《中华人民共和国药典》采用2个流动相系统分别测定连翘酯苷A和连翘苷的含量，操作步骤多；本试验采用乙腈和0.4%冰醋酸溶液作为流动相，进行梯度洗脱，同时测定两成分的含量，色谱条件的适用性好，杂质无干扰，操作简单，回收率高。在选择检测波长时，连翘酯苷A的最大吸收波长为330 nm，而连翘苷的最大吸收波长为277 nm，经过试验，在230、254、270、277、284、330 nm试验波长中，277 nm波长处两成分的检测灵敏度均较高，故选择277 nm作为检测波长。
由样品含量测定结果可知，配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量以干燥品计算（配方颗粒水分平均为2.4%，药材水分平均为4.3%），二者含量按原药材换算均达到药典要求（含连翘酯苷A含量不低于0.25%，连翘苷含量不低于0.15%）[1]，但是配方颗粒中连翘酯苷A的含量与标示的浓缩倍数（相当于原药材10倍）不相符，只有原药材含量的84.3%。
连翘配方颗粒生产工艺是以水为溶媒，经水提取、浓缩、喷雾干燥制成。连翘中以连翘酯苷A为代表的脂溶性成分，以水提，从药材到配方颗粒，转移率偏低，若要提高配方颗粒中连翘酯苷A的含量，必须改进配方颗粒的生产工艺。文献报道，选择不同浓度的乙醇溶液代替水作为提取溶剂，既能兼顾工业化大规模生产，又能最大限度地提高连翘酯苷A和连翘苷的提取率[5-7]。
中药配方颗粒在我国已经使用多年，由于配方灵活，患者服用方便，深受医生和患者的欢迎。但目前尚无统一的质量控制标准，质量参差不齐，所以尽快建立配方颗粒的质量控制方法和合理的质量标准，对于提高配方颗粒的质量、确保临床疗效具有非常重要的意义。
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[4] 吴国友.连翘药理作用研究进展[J].中医学报，2013，28（10）：1508- 1509.
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[6] 王进东，张应伟.正交法优选连翘酯苷最佳提取工艺[J].山西中医， 2008，29（8）：48-49.
[7] 靖会，李教社，杨银京.正交试验法优选连翘叶中连翘酯苷A的提取工艺[J].中国药业，2011，20（15）：39-41.
（收稿日期：2014-03-24；编辑：陈静）
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，重复进样5次测定，结果连翘酯苷A和连翘苷峰面积积分值的RSD分别为0.63%、0.15%，表明测定方法的精密度好。
2.6 重复性试验
取连翘药材和配方颗粒，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液并测定连翘酯苷A和连翘苷的色谱峰面积，结果连翘酯苷峰面积的RSD分别为1.82%、1.51%，连翘苷峰面积的RSD分别为0.53%、0.37%，表明测定方法的重复性符合要求。
2.7 稳定性试验
取连翘药材粉末，制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0、6、12、24 h各进样10 μL，测定连翘酯苷A和连翘苷的峰面积，结果RSD分别为0.91%、0.66%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的连翘药材粉末0.25 g（批号120701）和配方颗粒粉末0.025 g（批号1311001S）各6份，精密称定，分别精密加入连翘酯苷A和连翘苷对照品储备液3.5、1 mL，按样品测定方法，分别测定连翘药材及其配方颗粒中2种成分的回收率。结果连翘酯苷A的平均加样回收率分别为97.30%（RSD=1.02%）、97.38%（RSD=0.96%），连翘苷分别为99.13（RSD=0.58%）、99.20%（RSD=0.49%），见表2。
2.9 样品含量测定
精密称取连翘药材粉末0.5 g和配方颗粒的粉末0.05 g，按“2.2”项下方法制备样品溶液，取样品溶液和“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，用外标法计算连翘酯苷A和连翘苷的含量，结果见表3。
3 讨论
2010年《中华人民共和国药典》采用2个流动相系统分别测定连翘酯苷A和连翘苷的含量，操作步骤多；本试验采用乙腈和0.4%冰醋酸溶液作为流动相，进行梯度洗脱，同时测定两成分的含量，色谱条件的适用性好，杂质无干扰，操作简单，回收率高。在选择检测波长时，连翘酯苷A的最大吸收波长为330 nm，而连翘苷的最大吸收波长为277 nm，经过试验，在230、254、270、277、284、330 nm试验波长中，277 nm波长处两成分的检测灵敏度均较高，故选择277 nm作为检测波长。
由样品含量测定结果可知，配方颗粒中连翘酯苷A和连翘苷的含量以干燥品计算（配方颗粒水分平均为2.4%，药材水分平均为4.3%），二者含量按原药材换算均达到药典要求（含连翘酯苷A含量不低于0.25%，连翘苷含量不低于0.15%）[1]，但是配方颗粒中连翘酯苷A的含量与标示的浓缩倍数（相当于原药材10倍）不相符，只有原药材含量的84.3%。
连翘配方颗粒生产工艺是以水为溶媒，经水提取、浓缩、喷雾干燥制成。连翘中以连翘酯苷A为代表的脂溶性成分，以水提，从药材到配方颗粒，转移率偏低，若要提高配方颗粒中连翘酯苷A的含量，必须改进配方颗粒的生产工艺。文献报道，选择不同浓度的乙醇溶液代替水作为提取溶剂，既能兼顾工业化大规模生产，又能最大限度地提高连翘酯苷A和连翘苷的提取率[5-7]。
中药配方颗粒在我国已经使用多年，由于配方灵活，患者服用方便，深受医生和患者的欢迎。但目前尚无统一的质量控制标准，质量参差不齐，所以尽快建立配方颗粒的质量控制方法和合理的质量标准，对于提高配方颗粒的质量、确保临床疗效具有非常重要的意义。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159.
[2] 陈玲，李晓，李倩，等.连翘属植物化学成分的研究进展[J].现代药物与临床，2013，28（3）：441-445.
[3] 孟祥乐，李俊平，李丹，等.连翘的化学成分及其药理活性研究进展[J].中国药房，2010，21（43）：4117-4118.
[4] 吴国友.连翘药理作用研究进展[J].中医学报，2013，28（10）：1508- 1509.
[5] 黄桂丽，王彩云.连翘提取工艺研究[J].吉林医学院学报，2008，29（6）：322-324.
[6] 王进东，张应伟.正交法优选连翘酯苷最佳提取工艺[J].山西中医， 2008，29（8）：48-49.
[7] 靖会，李教社，杨银京.正交试验法优选连翘叶中连翘酯苷A的提取工艺[J].中国药业，2011，20（15）：39-41.
（收稿日期：2014-03-24；编辑：陈静）
