...诱导大鼠乳腺癌癌前病变动物模型研究概况
张华月 李琦 付晓伶
[摘要] 结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，畸形腺窝灶、腺瘤样息肉均被认为是结直肠癌重要的癌前病变。本文主要从化学诱导及基因工程两大方面综述了结直肠相关癌前病变的动物模型的造模方法，其中化学诱导法介绍了不同病理类别动物模型的构建方法，包括结直肠炎相关癌变模型、经典畸形腺窝灶癌前病变模型、β-链接素蓄积腺窝灶癌前病变模型及散发性结直肠腺瘤息肉模型；基因工程技术主要从基因突变、基因敲除及相关技术等方面进行论述，并针对每种造模方法的特点及应用方面做了详细阐述，旨在为研究结直肠癌前病变的动物造模提供依据。
[关键词] 畸形腺窝灶；化学诱导法；基因工程法；癌前病变；腺瘤性息肉；动物模型
[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（b）-0027-06
[Abstract] Colorectal cancer is one of the most common malignancies in the world， and aberrant crypt foci and adenomatous polyps are considered to be the most important precancerous lesions of colorectal cancer. This paper mainly describes the rectum related animal model method of precancerous lesions from two aspects： chemical induction and genetic engineering. The chemical induction method will introduce the method of establishing different models of categories， including colorectal inflammatory bowel disease related cancer model， classic aberrant crypt foci precancerous lesions， β-catenin-accumulated crypt precancerous model and sporadic colorectal adenomas polyps， while genetic engineering technology mainly argues from the gene mutation， gene knock out and related technology， and describes characteristics and applications of each building method in details， aiming at providing evidences for the research of animal models of colorectal cancer lesion.
[Key words] Aberrant crypt foci； Chemical induction method； Genetic engineering method； Precancerous lesion； Adenomatous polyp； Animal model
結直肠癌多是由“正常黏膜-畸形腺窝灶（aberrant crypt foci，ACF）-腺瘤-腺癌”途径发展而来[1]，是多步骤、多基因改变的过程。该发病途径中涉及“ACF”和“腺瘤”两个重要的癌前病变环节。其中ACF指一个或多个聚集成簇的形态异常的隐窝形成的病灶；结直肠腺瘤是以消化道多发腺瘤性息肉为特征的常染色体显性遗传病，包括家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）和散发性腺瘤病，主要与抑癌基因腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coligene，Apc）基因突变有关，有研究显示目前我国FAP发病率为1/1700～1/5000，且有明显的增加趋势；散发性腺瘤与遗传因素无关，是大肠上皮细胞增生形成散在的真性肿瘤[2]。已有研究报道，腺瘤体积与癌变率成正比，多发较单发腺瘤的癌变系数更高[3]。结直肠癌的确切病因和发病机制至今仍未阐明，也缺乏特异性有效治疗药物[4]。因此建立理想的、模拟人类结直肠癌前病变的动物模型对研究该病机制和开发临床治疗药物具有重要的意义。现将近年来国内外研究中提出的结直肠癌前病变模型做一系统论述，并对其特点加以评述。
1 化学诱导癌前病变模型
化学诱导法包括单药诱导法和复合药物诱导法。由于化学诱导剂的剂量、给药途径、诱导期、动物品系等因素的不同，其建立的结直肠相关癌前病变的动物模型种类也较丰富，比如自发性肠癌变动物模型、炎症性肠癌变动物模型等。
1.1 结直肠炎相关癌变模型构建
通过葡聚糖硫酸钠（DSS）、二甲肼（1，2-dimethylhydrazine，DMH）、氧化偶氮甲烷（AOM）等化学诱导复合法可制备溃疡型结直肠炎癌变（ulcerative colitis associatedcarcinogenesis，UCAC）模型。目前有4种造模方法，第1种为单药DSS诱导法，予5%DSS连续饮用5 d，出现体重下降、排便增多、便溏甚至血便等急性肠炎症状，该造模方法简单易操作，但癌变率不高，不建议用于癌变造模。第2种为AOM与DSS联合诱导法，予第1天腹腔注射AOM（12.5 mg/kg），第6天起连续5 d饮用2.5%DSS水，三周三循环。4周出现急性黏膜炎和ACF，7周出现腺瘤中-重度不典型增生改变，14周出现腺癌。该造模方法较好地模拟人类肠炎向肠癌进展过程。第3种为DMH与DSS联合诱导法，予腹腔注射DMH（20 mg/kg），1周2次；继而3%DSS，连续饮用2周，三周三循环法，20周出现稀便、腹泻、大便隐血（+）和肉眼血便中的任一症状[5-6]。镜下见黏膜息肉样隆起，高级别上皮内瘤变、部分见癌变。该造模方法可较好地观察炎症向癌逐渐转化的过程，但造模时间和实验周期较长。另有研究证实高脂饮食是癌前病变中溃疡型结直肠炎及其不典型增生的重要致病因素[7]。高脂饮食联合AOM/DSS诱导法更符合临床脂代谢异常与肠息肉发病的密切相关性。以饮用3%DSS水3 d+灭菌水4 d为1个循环周期，重复9个周期。前3个循环周期的每周第1天，腹腔注射AOM（10 mg/kg）。高脂饲料和DSS同步干预。第9个周期所有小鼠均出现腹泻、稀便，部分小鼠有肉眼血便。该模型造模周期短，说明高脂饮食可以加重AOM/DSS诱导的小鼠UC及其不典型增生。
因此成功建模要综合考虑动物种属、周龄、AOM及DSS浓度、分子量及暴露时间。这可能与肠道菌群失调、巨噬细胞功能障碍、负电荷影响肠上皮合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障等因素有关。AOM/DSS化疗诱导复合法造模具有致癌方法简单、成瘤率高、周期短、可重复性强的特点，由于此造模方法能很好地模拟慢性肠道炎症诱发癌症的生理病理过程，故而近年来被广泛用于炎症相关性癌症形成机制的研究[8]，但病变主要为化学损伤所诱导的慢性炎症性癌变，故无法模拟其他因素的自发性慢性癌变，因而稍显不足。
1.2 经典ACF癌前病变模型
AOM、DMH、4-氨基联苯（4-aminobipheny1）、N-亚硝基-N-正-甲基尿素（N-nitroso-N-methylurea）和3-甲基蒽胆（3-methylcholanthrene）等遗传毒性致癌物均能通过使DNA碱基甲基化，诱导生成ACF，诱发结肠黏膜肿瘤形成。ACF是最小最早期的大肠黏膜病变，是啮齿类动物和人结直肠癌发展过程中最早阶段的显微损伤，是评价结直肠肿瘤药物疗效的良好生物学标志。魏华等[9]及邱云平等[10]采用单药DMH化学诱导法，于雄性Wistar大鼠颈背部皮下注射DMH（30 mg/kg），1次/周，注射2周，9周造模成功；或者DMH（20 mg/kg），1次/周，注射10周，16周造模成功。陈立勇[11]应用单药AOM诱导法从实验第2周开始对雄性Wistar大鼠腹腔注射AOM（15 mg/kg、1.25 g/L），1次/周，连续2周，13周造模成功。大鼠结肠内发现大量ACF，且PCNA-L1和AgNORs显著升高，提示该肠组织细胞有显著的增殖活性。布图雅等[12-13]应用AOM/DSS法对雄性Balb/c小鼠给予腹腔注射AOM（10 mg/kg，1 g/L）1次，继而饮用3%DSS溶液1周，三周三循环法，造模9周，20周后可见小鼠体重减轻，倦怠拱背，有黏液血便，并出现脱肛；肉眼观察小鼠结肠，以散在、多发性息肉状隆起性病变为主，HE染色见异常隐窝呈不规则分支。ACF大量出现，大小不等，核分裂多、排列拥挤到肠腺腔面，NF-κB、COX-2含量显著升高。
AOM与DMH单药化学诱导法造模时间均较短，而AOM/DSS联合诱导法建模时间过长，其检测方法虽较简便，但模型判断主观性强，病理分析困难，仍缺乏组织学证据，ACF是肠癌发病过程的中间重要环节，同时ACF模型怎样发展为腺瘤，能否替代结肠癌模型甚至人类结肠癌用于一些科学研究尚存争议。
1.3 BCAC癌前病变模型构建
日本学者Yamada等[14-16]对近交系F344大鼠注射DMH建立BCAC动物模型，首次提出β-链接素蓄积腺窝灶（β-catenin-accumulated crypt，BCAC）是AOM诱导F344大鼠模型中一种与结直肠癌关系比经典ACF更为密切的癌前病变，其进展成腺瘤和腺癌的潜在危险性更高。Yamada等[17]和Kuno等[18]实验提示，BCAC在肠黏膜中的分布密度及复杂性更明显，故BCAC在形态学观察、分子病理学研究、细胞增殖凋亡、预防结肠癌形成、筛选抗肿瘤药等方面显示出更大的优势。但目前的研究还不够深入，可重复性不强，且迄今还未在人的肠黏膜证实有相同的病变，其特征有待进一步明确。
1.4 散发性结直肠腺瘤息肉模型构建
目前常用SD品系、F344大鼠做造模動物，诱导癌变发生率高，解剖结构更易辨认，且较接近结直肠息肉自然发生、发展过程。王伟杰等[19]对雄性SD品系大鼠皮下注射DMH（20 mg/kg），每周1次，持续18、20周时诱导出增生性息肉和腺瘤性息肉，此方法操作简单，造模周期短，成息肉率高，更贴切模拟人结直肠息肉自然生长的过程，为开展人结直肠息肉的研究提供一种理想的动物模型。另有Watanabe等[20]曾于1987年采用直肠内注射N-甲基亚硝基脲（MNU）方法诱导F344大鼠造模成功，于30～40周出现多发性肿瘤。该造模方法癌变发生率高，但造模耗时长，较少使用。单纯高剂量致癌剂-癌前病变模型组（AOM组），第1天开始给予腹腔注射AOM（10 mg/kg），每周1次，7周时可见到ACF灶，14周见腺瘤样突起，灶性中-重度不典型增生。综上，我们业已用MNU、DMH、AOM诱导F344大鼠结直肠的癌前病变。单药DMH法及MNU法的成癌性高，但造模时间长。AOM诱导F344大鼠造模方法最短，简单易重复，但该方法还需进一步实验证实。
张耀朋等[21]对雄性SD大鼠采用DMH和PPAR-γ受体拮抗剂GW9662（促瘤剂）诱发结直肠散发性腺瘤模型。首剂量为腹腔注射DMH（120 mg/kg），2周后皮下注射20 mg/kg加强1次；2周后予GW9662，首剂量静脉注射0.3 mg/kg，后静脉注射0.1 mg/（kg·周）；12周造模成功，DMH+GW9662组发现腺瘤平均大小1.3 mm。腺瘤诱导成功率为87.5%，该方法成功率高，诱导时间短，腺瘤荷瘤率较高，组织量多且评价客观，较单纯DMH诱导的大鼠结肠癌息肉模型更具实用价值。与传统的结直肠炎癌前病变模型和ACF模型相比，具有经济、实用、高效、稳定的优点，可以弥补两个传统模型的不足。但该模型涉及GW9662目前仅应用于体外的细胞学研究，其在体内的研究很少，药代动力学特点尚待阐明，仍需深入研究。
2 基因工程动物模型
迄今为止，与肠道肿瘤相关的基因突变小鼠或基因敲出小鼠等基因工程小鼠的种类已有30多种[22]。目前基因工程小鼠模型有转基因Apc（Min/+）变小鼠、双基因缺陷ApcMin/+杂合小鼠、基因敲除小鼠如ApcΔ14/+基因小鼠、ApcΔ716/+基因敲除小鼠、PTEN肠息肉小鼠以及BMP息肉小鼠模型等。
2.1 转基因Apc（Min/+）突变小鼠模型的构建
目前转基因ApcMin/+突变小鼠是国际公认的家族腺瘤性息肉病和散发性大肠癌癌前病变的动物模型，具有可遗传性、自发性和稳定性的特点[23-24]。叶志金等[24]研究发现ApcMin/+小鼠9周龄时发生肠道腺瘤，从9～24周龄，腺瘤体积持续增大，但小肠腺瘤数目不再增加，15周以后腺瘤快速生长，24周时由于腺瘤体积过大及其对营养的消耗而导致贫血，从而致多数小鼠死亡。Yamada等[25]研究发现，成年小鼠小肠中肉眼可见的瘤体数量明显多于结直肠，结直肠中瘤体组织为腺瘤或腺癌，并在其肠黏膜中发现有异常隐窝。镜下结直肠中的病变损及面积明显小于小肠，但结直肠病变的发生率却明显高于小肠病变。此外有研究发现，在DSS诱导下的Min小鼠要比未做任何处理的Min小鼠在生成肿瘤数量和形成上更显著；也有研究证实，EphB表达下降可以加速Min小鼠肠道肿瘤发生；另有研究发现Min小鼠中Mom1、Mom2、Mom7是可调节肿瘤数量的遗传位点，其中Mom2基因位点可抑制肠道肿瘤发生。ApcMin/+小鼠常发生小肠肿瘤，与人类常见的结直肠肿瘤尚存在一定差异，且因小肠较长的生理特征使其不利于实验研究；另一方面有研究提示ApcMin/+小鼠肠道息肉一般是良性的，不具有侵袭性，仅有极少数会发展为侵袭性的腺癌，这与FAP最终进展为侵袭性的结直肠腺癌不一致。其次大多数Min模型小鼠的生存期均少于120 d，且常伴有慢性贫血的症状[26]。目前，已陆续有研究人员制备出和Apc基因高频突变位点有关的突变小鼠，如APC基因突变系小鼠Δ14、Δ716、Δ1309和1638N等已广泛被应用。
2.2 单基因敲除小鼠模型
单基因缺陷小鼠靶点单一且明确，能为临床药物的机制研究提供重要实验依据，已陆续有研究人员制备出一系列基因敲除小鼠（knockout mice），如p53基因敲除小鼠、IL-10基因敲除小鼠、Gαi2基因敲除小鼠、APCloxP等位基因特异性敲出小鼠等众多基因敲出小鼠模型[27]。众多基因敲出小鼠模型中，ApcΔ716/+基因敲除小鼠较ApcMin/+小鼠模型可生成更多的小肠微小息肉；在对APC△1309小鼠模型研究中，Niho等[28]研究发现处于高脂血症状态下的APC基因突变小鼠可以抑制小肠腺瘤的形成。
周素丽等[29]研究发现MSH2基因缺失的小鼠会致使抑癌基因失活，相较而言，其肠道腺瘤的发生率较正常小鼠显著升高；廖超男等[30]利用Cre-LoxP重组酶系统，在肠道绒毛和隐窝上皮細胞条件性敲除APC基因，并将VillinCre小鼠和APCfl/fl小鼠杂交得到VillinCre；APCfl/+小鼠，其后进一步与APCfl/fl小鼠杂交，得到VillinCre；APCfl/fl小鼠，将其解剖发现其自发产生肠道肿瘤，免疫组化显示激活Wnt信号通路，成功地构建了小鼠肠道条件性敲除APC基因腺瘤模型。Cre-LoxP重组酶系统是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心，现已在新型基因打靶中获得广泛应用[31]。
2.3 双基因缺陷ApcMin/+杂交小鼠模型
双基因缺陷ApcMin/+小鼠指ApcMin/+小鼠与某种基因缺陷的小鼠进行交配，得到子代小鼠，通过对基因型的鉴定，筛选出具有APC基因突变及另一种基因突变的双基因突变子鼠。近年来，基于ApcMin/+小鼠模型所建立起来的双基因突变的小鼠模型已有一百多种，主要用于研究某一基因对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤发生和发展的影响及相关的机制。胡曦文等[33]用ApcMin/+雄性小鼠与p110δD910A/D910A雌性小鼠杂交成功构建ApcMin/+；p110δD910A/D910A小鼠模型并得以稳定传代，并确认肠道肿瘤的初步表型。时洪凯等[34]建立子代BubR1+/-ApcMin/+复合突变小鼠模型。该模型成瘤时间短，成瘤率较高且肿瘤组织的病例和生物学特征稳定，能较好地模拟人类结直肠肿瘤自然生长的过程。ApcΔ716/+小鼠是家族性腺瘤性息肉病模型鼠，Aoki等[35]将ApcΔ716敲除小鼠和Cdx2+/-突变小鼠进行杂交，子代ApcΔ716Cdx2+/-小鼠结直肠息肉的发生率及数量显著增加，但是目前其机制尚不清楚。沈晓东[36]将其与Id2敲除的基因工程小鼠杂交，获得ApcΔ716/+Id2-/-杂交小鼠，实验证实Id2的缺失能抑制ApcΔ716/+小鼠肠道肿瘤的发生，推断Id2基因在人类肠道肿瘤中可能发挥着促进肿瘤形成的作用。
2.4 BMP息肉小鼠模型构建
BMP息肉小鼠是指采用跨胎盘RNAi技术沉默siBMP4构建的小鼠肠道息肉模型。向丽[37]采用跨胎盘RNAi技术，在孕鼠的尾静脉注射沉默BMP4基因的质粒，通过跨胎盘RNAi干扰子一代小鼠的BMP4的表达构建模型小鼠。BMP息肉小鼠模型第8周经HE染色见腺体上皮增生，病理显示息肉生成，第10周肿块明显增多，但未见腺癌样改变。实验通过跨胎盘RNAi技术首次成功构建了BMP息肉小鼠模型，证实了BMP参与结直肠息肉的形成，为更深入地研究结直肠息肉发生、发展及恶变的机制探寻了一种新的方法，此技术方法还有待进一步的完善并推广。
2.5 运用CRISPR 技术构造小鼠模型
CRISPR技术是新一代的基因组编辑工具，能够剪断DNA分子，完成以RNA为导向的DNA识别及编辑，并对靶基因进行删除、添加、激活或抑制等各种改造。Drost等[39]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向下调了结直肠癌细胞中结直肠细胞家族性腺瘤样结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）易感基因、抑癌基因p53和DPC4，并导入K-Ras基因。此技术对构建结直肠癌前病变模型也提供了研究的新方法新思路。但是仍存在一些问题，CRISPR/Cas9系统可同时切割基因组中相同或高度相似的DNA同源序列，导致非靶点突变即脱靶效应[40-42]。
綜上所述，一个成功的结直肠相关癌前病变动物模型是可以从发病机制、组织病理学、临床表现等多方面模拟出与人类相似的肠腺瘤性息肉的特征。国内外对肠相关癌前病变动物模型的鉴定主要依靠PCNA-L1和AgNORs等细胞增殖活性的检测及ACF等组织病理学检测等方面。目前，构建结直肠息肉模型有多种方法，如动物自发结直肠癌癌前病变模型、致癌因素诱发动物模型、遗传工程动物模型、小鼠自发的移植瘤模型和人源肿瘤细胞移植瘤模型，但一般情况下多从化学药物诱导及基因工程两大方向着手，其中化学诱导法中的AOM/DSS复合化学法诱发癌前病变是目前较常用的动物模型，病变主要发生在结肠，能较好地模拟人类慢性肠道炎症诱发癌症的生理病理过程，是研究炎症相关性癌症和药物筛选的理想动物模型。基因工程小鼠模型中的APCMin/+小鼠是国际公认的家族腺瘤性息肉病（FAP）和散发性大肠癌癌前病变的动物模型，具有可遗传性、自发性和稳定性的特点，但极少会发展为侵袭性的腺癌，这与人类的家族性结肠腺瘤息肉最终进展为侵袭性的结直肠腺癌结局不一致。另外与结直肠相关的癌前病变如ACF和BCAC等临床特征，还需更加客观可靠的鉴定方法。今后动物模型的鉴定仍需从多方面进行评估，不仅仅要模仿人类癌前病变的某单一方面特征。我们期待建立更理想的结直肠癌癌前病变动物模型，以便更好地指导我们从不同角度探讨人类肠道相关癌前病变的病因、发病机制及治疗药物的疗效等研究。
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