大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬相关基因的研究以及人工合成E 选...
李燕则 郭永清 卫建峰 郑李娜
[摘要]自噬是真核生物进化上高度保守的一种物质分解代谢途径，主要用于分解和回收利用细胞内受损的细胞器、错误折叠的长效大分子。但自噬的过度激活，对于机体来说却是一种损伤机制。脑缺血再灌注损伤的损伤机制除与机体多种病理生理过程有关外，自噬也发挥了相当重要的作用。自噬逐渐变成预防和治疗人类多种重大疾病的靶点，其机制研究也变成研究焦点。本文旨在概括自噬的相关概念，研究自噬与脑缺血再灌注损伤的关系，介绍自噬发生的相关信号通路。
[关键词]脑缺血再灌注损伤；自噬；信号通路；mTOR
[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（c）-0029-04
Progress autophagy mechanism and autophagy-related signaling pathways after cerebral ischemia-reperfusion injury
LI Yan-ze1 GUO Yong-qing2▲ WEI Jian-feng2 ZHENG Li-na2
1.Department of Anesthesiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anesthesiology，Shanxi Provincial People′s Hospital，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China
[Abstract]Autophagy is a highly conserved material decomposition and metabolism pathway in the evolution of eukaryotes，which allows the orderly degradation and recycling of intracellular damaged organelles or misfolded long-acting macromolecule.But hyperactivation of autophagy is an injury mechanism for the body.The injury mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury is not only related to various pathophysiological processes，but also plays an important role in autophagy.Since autophagy has gradually become a target for the prevention and treatment of a variety of major diseases in human beings，its mechanisms arose increasing attention.This paper aims to summarize the related concepts about autophagy，study the relationship between autophagy and cerebral ischemia reperfusion injury as well as introduce the signaling pathways involved in autophagy.
[Key words]Cerebral ischemia reperfusion injury；Autophagy；Signal path；mTOR
世界衛生组织的数据表明，脑血管疾病是造成人类死亡的主要原因之一，因此，找到该种类型疾病正确的治疗途径有助于脑血管疾病工作的顺利展开[1]。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury）是指脑组织因缺血导致其结构和功能的损害，但是有时缺血后再灌注不仅不能使结构和功能恢复，反而加重其损害，其损害严重程度与缺血时间、需氧程度及残余血流量有关，损伤区根据血流残存的多少分为中心区和半暗带区，中心区细胞死亡主要是细胞坏死，而半暗带区主要是细胞凋亡和自噬。半暗带区细胞仍有代谢活力，故对该区进行抗缺血治疗是阻止细胞恶化，减轻脑缺血再灌注损伤的重要手段。
1自噬的相关概念
人体内环境的稳态主要靠物质合成与分解代谢的正常进行来维持。自噬是真核生物细胞一条重要的物质分解代谢途径，泛素蛋白酶体途径是另一条重要途径，二者的功能和结构各有特点[2]。细胞内受损的细胞器、错误折叠的高效大分子主要是通过自噬途径分解，进而实现细胞内环境的高效稳定运转。依据底物与溶酶体结合方式的不同将自噬分为三类：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy）。它们各有分工，在真核细胞中，巨自噬最容易发生，与脑缺血再灌注损伤的关系也最为密切。巨自噬的发生主要序贯性经历下面4个步骤：①诱导自噬发生；②形成自噬体；③自噬体与溶酶体膜的融合；④降解自噬体。微自噬指溶酶体膜内陷包裹目标靶物并被水解酶分解的过程[3]，而分子伴侣介导的自噬则指底物特定氨基酸序列（如KFERQ）在胞浆中的分子伴侣热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSC70）的介导下识别溶酶体膜上特异的受体溶酶体相关的膜蛋白2a（lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a），使得底物与溶酶体结合，并由水解酶降解的过程[4]。
2自噬与脑缺血再灌注损伤
机体正常的自噬比较保守，其发生维持在适当水平，主要用于清除胞内受损的细胞器、错误折叠的长效大分子等，以维持细胞高效稳定的代谢需求[5]。然而，超过限度自噬并不能维持细胞稳定，一定程度上会加剧损伤，促进细胞死亡。该种细胞死亡是一种细胞程序性死亡，被称为自噬性细胞死亡或Ⅱ型程序性细胞死亡[6-8]。
Wang等[9]研究发现，大鼠全脑缺血再灌注后30 min，透射电镜下可见海马自噬体及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ形成，24～48 h仍旧维持在较高水平。脑缺血前30、60 min，在脑立体定位仪辅助下向侧脑室内靶向注射自噬抑制剂3-MA，发现海马神经细胞死亡抑制组织蛋白（cathepsin）B释放减少和原位末端标记（TUNEL）阳性细胞数量降低。可见，自噬参与脑缺血再灌注损伤，抑制自噬亦可显著减轻神经细胞缺血再灌注损伤。
3脑缺血再灌注损伤后自噬发生的相关信号通路
准确高效的信号通路调节，使得细胞能够应对各种外界刺激并维持自身稳定。TOR（target of rapamycin）是一种调控细胞周期、生长和增殖的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞自噬信号通路的一种调控蛋白，外界不良刺激引起的细胞因子的变化可被TOR感知，影响自噬的发生。发生细胞内氧糖剥夺等，都可激活或抑制TOR活性，从而影响细胞自噬的发生[10]。
而在哺乳动物中，主要存在正常处于活化状态TOR的同源物哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，降低自噬的发生水平。TOR/mTOR能形成 TORC1/mTORC1和TORC2/mTORC2两种复合物。mTORC1包括PRAS40（proline-rich akt substrate 40 kDa）、也称为类G蛋白β亚基蛋白GβL（mLST8）、mTOR和Raptor（regulatory-associated protein of mTOR）。而雷帕霉素作用的主要靶点是Raptor[11]，雷帕霉素与其结合后，可抑制mTORC1的活性而诱导自噬的发生。mTORC2包括mTOR、mSin1（mammalian stress-activated protein kinase-interacting protein 1）、Protor（protein observed with rictor）和Rictor（rapamycin insensitive companion of mTOR），而Rictor对雷帕霉素不敏感。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可以被mTORC2磷酸化，影响细胞骨架的形成[12]，但关于mTORC2和自噬的关系却鲜有报道。
3.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路
研究发现，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt/mTOR信号通路对自噬起着重要的调控作用，mTOR作为该通路中调控自噬的关键因子，它的活性是自噬体形成、成熟的关键[13-16]。
PI3K是一种具有蛋白激酶及磷脂激酶的双重活性的蛋白，主要存在于细胞质中。外界刺激引起细胞一系列变化信号，激活跨膜的酪氨酸激酶，从而招募PI3K的p85亚基，继而P110亚基接收信号改变，激活PI3K[17]。PI3K可通过一系列信号传递激活Akt，通过下列途径激活mTOR：一是直接激活mTOR；二是通过抑制TSC1 /TSC2复合物的形成，间接激活mTOR。
结节性硬化复合物（tuberous sclerosis complex，TSC）是mTOR上游可调节mTOR活性一种化学分子。TSC2被称为GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），可以通过激活GTP酶，使脑内Ras同系物（ras homolog enriched in brain，Rheb）Rheb-GTP由活化型变成失活的Rheb-GDP[18]。活化型的Rheb-GTP能够通过Raptor，激活mTORC1。Akt激活后，磷酸化TSC2，阻止TSC1/2复合物形成，进而阻止Rheb-GTP失活，激活mTORC1，抑制自噬。Raf-1-MEK1/2-ERK1/2也可抑制TSC1/TSC2，最终激活Rheb-mTORC1，抑制细胞自噬的发生[19]。
这一信号通路调控受第十号染色体缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10，PTEN）的负性调控，PTEN可以通过抑制PI3K的活性，诱导自噬的发生[17]。
细胞在稳定状态时，有活性的mTOR可以引起自噬蛋白Atg13高度磷酸化，从而降低Atg13和Atg的活性[20]，使其招募下游PI3K、LC3的能力下降，自噬体形成水平降低，故而降低自噬发生水平，从而达到精确调节细胞代谢的目的。
3.2 AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路
研究发现，p38 通路能够诱导自噬的发生[21]。在缺血性脑疾病中，抑制p38可以抑制自噬，从而达到保护脑损伤的目的。
AMPK的另外一条通路ERK1/2也对自噬起正性调控作用。db/db小鼠中，ERK1/2活性下降或增强导致自噬和自噬相关蛋白Atg-7表达的减少或增加，进而抑制或促进自噬[22]。
AMPK可感知能量的变化，当正常机体突然遭到应激时，如缺血缺氧，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平下降，即会激活AMPK，活化的AMPK可以抑制TSC2磷酸化，使Rheb-GTP失活，从而降低mTORC1的活性，激活自噬[23]。此外AMPK可通过DNA损伤反应调节基因1（regulated indevelopment and DNA damage response 1，REDD1），增强或抑制TSC1/2的活性。在机体缺血缺氧时，AMPK可以诱导REDD1的表达，使得TSC2脱离其抑制性结合蛋白14-3-3，使得活化型Rheb-GTP变成失活Rheb-GDP，进而促进mTORC1失活[24]，促进自噬发生。
3.3 P53途径
p53亦参与调控细胞自噬。正常机体的p53含量较低，在细胞核中，通常与鼠双小蛋白2（murine double minute 2，MDM2）结合成异二聚体，调控细胞的增殖分化。当细胞受到外界各种突然刺激时，如缺血缺氧、氧化应激、化学药物等，都能引起细胞内的蛋白激酶和NK（c-Jun amino-terminal kinase）磷酸化而激活p53。研究表明，p53在細胞核和细胞质中以不同调节方式调节细胞自噬。在细胞核中，p53主要通过转录依赖性方式促进细胞自噬的发生。而在细胞质中的p53能以转录非依赖方式抑制自噬发生，主要是通过抑制AMPK活性和激活mTOR来实现的[25-26]。
在细胞中，p53亦可通过直接或间接激活mTOR上游一些调节因子而影响细胞自噬，这些因子主要包括PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10）、AMPK、TSC2等。p53也可以直接反式激活TSC2，抑制mTOR的活性，上调细胞自噬。
p53在一定条件下可以激活蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）以及促凋亡蛋白Bcl-2家族成员Bax、Bad、Bnip3和Puma等，这些因子可使自噬蛋白Beclin1与Bcl-2/Bcl-xL相互分离，而上调细胞自噬[27]。可见，p53可通过下调mTOR的活性或其他调节方式促进细胞自噬发生。
4小结
综上所述，随着分子生物学中越来越多信号通路机制的不断揭示，近些年来研究脑缺血再灌注损伤后自噬的相关信号通路作用机制的文献也逐渐增多，但尚有未发现的信号通路。究竟通过何种措施在特定时机作用于相关信号通路，进而通过减轻自噬而减轻脑缺血再灌注损伤程度，还需要大量实验与实践来进一步探索。本文所述mTOR作为调控自噬通路的关键蛋白，阐明其所在信号途径及其作用，将对神经系统缺血再灌注脑损伤疾病提供至关重要的的治疗方案。
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（收稿日期：2018-01-08 本文編辑：孟庆卿）
