葛根素口服微乳在Caco2细胞模型中摄取特性与研究.pdf

郭闪 田春鸿 贺元 张晓霞 田莉

摘要：目的 研究芹菜素在Caco-2细胞的摄取特性。方法 采用Caco-2单层细胞模型，研究芹菜素在不同时间、浓度、温度、pH值、P-糖蛋白抑制剂条件下对细胞摄取的影响，采用HPLC测定芹菜素在细胞中的含量。结果 芹菜素在0.33～80 ?g/mL范围内线性关系良好（r=0.999 4）。芹菜素在Caco-2细胞的摄取呈现一定的时间、浓度和pH值依赖性，且P-糖蛋白抑制剂不能增加其摄取量。结论 该方法操作简单、灵敏，P-糖蛋白未参与芹菜素的转运过程，芹菜素在Caco-2细胞的摄取主要是被动转运。

关键词：芹菜素；Caco-2细胞；摄取；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0074-05

Uptake Study on Apigenin in Caco-2 Cells

GUO Shan1， TIAN Chun-hong2， HE Yuan1， ZHANG Xiao-xia1， TIAN Li1，3

1. College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

2. Midong District Traditional Chinese Medicine Hospital of Urumqi， Urumqi 831400， China；

3. Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formula， Urumqi 830011， China

Abstract： Objective To study the uptake property of apigenin in Caco-2 cells. Methods Caco-2 cell monolayer model was used to research the effects of apigenin on cell uptake in different times， concentrations， temperatures， pH values， and P-gp inhibitors. HPLC was used to determine the content of apigenin in cells. Results The linearity of apigenin concentration curve was found in good linear range of 0.33–80 ?g/mL （r=0.999 4）. Uptake determination of apigenin in Caco-2 cells depended a certain of time， concentration and pH values， and P-gp inhibitors could not increase the apigenin uptake. Conclusion This method is simple and sensitive. P-gp is not involved in apigenin transport process， and uptake of apigenin in Caco-2 cells is mainly passive transported.

Keywords： apigenin； Caco-2 cells； uptake； HPLC

芹菜素是一种广泛分布于水果、蔬菜、豆类、茶叶、中药材中的黄酮类化合物，芹菜中含量最高。芹菜素的药理活性较为广泛，具有明确的抗肿瘤、抗氧化、降压、抗炎、抗菌、抗病毒及心脑血管保护等药理作用[1-2]，是一种具有研究潜力的活性成分。芹菜素在高亲水性和非极性溶剂中的溶解性差，几乎不溶于水，但可溶于热乙醇、二甲基亚砜（DMSO）和稀氢氧化钾溶液[3]。鉴于活性成分的药效发挥与其吸收特性密切相关，而目前对芹菜素体内吸收特性的研究较少，本试验采用Caco-2单层细胞模型研究芹菜素的摄取特性，为含芹菜素的中药及其制剂的剂型设计提供药動学依据。

1 细胞、仪器与试药

Caco-2细胞株购自武汉博士德生物工程有限公司，试验所用细胞传代数为20～40代。

1220LC高效液相色谱仪（美国Aglient公司），XS105型电子天平（德国梅特勒-托利多公司），TDL-40B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），超净工作台（苏州净化设备总厂），CO-150型二氧化碳孵箱（美国NBS公司），MX6R型倒置显微镜（宁波舜宇仪器有限公司），SK-1型快速漩涡混合器（江苏金坛医疗仪器厂），pHS-3型精密pH计（上海精科雷磁仪器厂），SpectraMax190酶标仪（美国，Molecular Devices公司）。

芹菜素对照品（apigenin，批号150623，纯度≥98%），上海谷研实业有限公司；DMEM培养基、非必需氨基酸、青霉素-链霉素双抗液、胰蛋白酶、Hank's平衡盐溶液（HBSS）、磷酸盐缓冲液，美国Hyclone公司）；胎牛血清，美国Gibco公司；BCA蛋白分析试剂盒，美国Thermo公司；12孔培养板，美国Costar公司；增强型RIPA裂解液（批号AR0102-100），武汉博士德生物工程有限公司；维拉帕米（批号100223-200102）、环孢菌素A（批号130495-201303），中国食品药品检定研究院；二甲基亚砜（分析纯），Sigma公司；甲醇、乙腈（色谱纯），美国Fisher Scientific公司；超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 Caco-2细胞中芹菜素测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

COSMOSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.2%磷酸（40∶60），流速1 mL/min，检测波长340 nm，进样量20 ?L，柱温25 ℃。

2.1.2 专属性试验

在“2.1.1”项色谱条件下测定空白细胞混悬液、空白细胞混悬液+芹菜素对照品、芹菜素细胞摄取样品，色谱图见图1。芹菜素细胞摄取样品的保留时间为18.78 min，空白细胞混悬液+芹菜素对照品和芹菜素细胞摄取样品的特征峰保留时间一致，空白细胞混悬液在保留时间内无杂质干扰，芹菜素色谱峰与相邻色谱峰的分离度>1.5，理论塔板数>3000。

2.1.3 线性关系考察

精密称取芹菜素对照品适量，以Hank's平衡盐溶液-空白细胞裂解液-甲醇（2∶2∶96）混合液溶解稀释为0.33、1.30、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 ?g/mL系列浓度的芹菜素对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，外标法定量，以芹菜素峰面积（A）对浓度进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程A=1 000 000X-220 881（r=0.999 4），表明芹菜素在0.33～80.00 ?g/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验

按“2.1.3”项下方法分别配制芹菜素低、中、高浓度（5、25、50 ?g/mL）的质量控制样品，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积。1 d内重复测定6次，日内精密度RSD为0.068%～0.521%；每日测定1次，连续测定6 d，日间精密度RSD为1.36%～4.22%。表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

按“2.1.3”项下方法分别配制芹菜素低、中、高浓度（5、25、50 ?g/mL）的质量控制样品，按“2.1.1”项下色谱条件测定样品在37、25 ℃条件下放置3 h及在4、-20 ℃条件下放置3 d的稳定性，记录峰面积。结果芹菜素RSD分别为0.09%～0.40%、0.055%～0.57%、1.91%～2.47%、1.14%～3.97%。表明样品稳定性良好。

2.1.6 重复性试验

按“2.1.3”项下方法分别配制芹菜素低、中、高浓度（5、25、50 ?g/mL）的质量控制样品各6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果RSD为1.57%～4.82%，表明本方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验

按“2.1.3”项下方法分别配制芹菜素低、中、高浓度（5、25、50 ?g/mL）的质量控制样品，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样3次，记录峰面积，计算回收率。结果回收率分别为91.87%、98.24%、104.46%，符合测定要求。

2.2 芹菜素对Caco-2细胞生长的影响

2.2.1 细胞培养

将Caco-2细胞培养于10%DMEM高糖培养液（含10%FBS、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸等）中，在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，当细胞达到80%～90%融合时，取对数生长期的Caco-2细胞，用胰酶消化后，用10%完全培养液混悬，调整细胞密度至适宜浓度（约5×105个/mL），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2.2 形态学观察

取指数生长期的Caco-2细胞，按“2.2.1”项下方法消化分散制备单细胞悬液，调整细胞密度，以5×104个/孔接种于96孔板，培养24 h后更换新培养基，每孔加入200 ?L不同浓度的芹菜素溶液（芹菜素终浓度为0.5、5、15、25、50、100、200、400 ?g/mL），DMSO体积分数<0.5%，每个浓度设置6个复孔，对照组加入新鲜10%DMEM高糖培养液代替芹菜素溶液，培养48 h后置于显微镜观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生长密度、树突形态及融合状态等。结果对照组细胞生长良好，形态正常。加入不同浓度芹菜素溶液后，细胞数量和形态均出现了不同程度的变化：浓度<25 ?g/mL时，细胞形态和数量均无明显变化；浓度为50 ?g/mL时，细胞数目显著减少，形态有较明显变化；浓度为100 ?g/mL时，出现细胞分布稀疏，樹突明显减少；浓度为400 ?g/mL时，细胞树突减少或消失，不能相互融合形成网状结构。细胞形态见图2。鉴于芹菜素质量浓度对细胞形态及数量存在影响，摄取试验应设定浓度在100 ?g/mL以下。

2.2.3 芹菜素对Caco-2细胞增殖率的影响

采用MTT法检测细胞活性。细胞悬浮液处理同“2.2.2”项下操作，培养基作调零孔为空白组，不含药物孔为阴性对照组，待测物为实验组，均于孵育24、48、72、96 h每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 ?L，培养箱中孵育4 h，弃去培养液和MTT，向各孔中加入150 ?L DMSO，溶解残留的MTT甲臜结晶，震荡混匀后用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞增殖率，确定待测物对Caco-2细胞的安全浓度范围。细胞增殖率（%）=（实验孔OD值-空白孔OD值）÷（对照孔OD值-空白孔OD值）×100%[4]。不同浓度芹菜素对Caco-2细胞增殖率的影响见表1。可见，芹菜素浓度<200 ?g/mL，细胞增殖率均大于85%，因此，后续考察芹菜素浓度对摄取的影响设定浓度应小于200 ?g/mL。

2.3 芹菜素在Caco-2细胞的摄取

2.3.1 细胞培养

将Caco-2细胞按“2.2.1”项下方法培养后，用10%完全培养液混悬，调整细胞密度至6×104个/mL，接种于12孔板内，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养14 d，测定细胞跨膜电阻>300 Ω·cm2，可用于药物摄取实验[5]。

2.3.2 样品处理

将细胞培养板从培养箱内取出，吸弃含药培养液，用4 ℃ HBSS快速清洗3遍，加入胰蛋白酶消化后以完全培养基终止消化，收集细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入4 ℃ HBSS 500 ?L重悬细胞，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入500 ?L RIPA细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀，超声处理（250 W，25 kHz）25次，20 s/次（冰上操作），12000 r/min离心5 min，所得上清液一部分以BCA法測定蛋白定量，另一部分加入3倍甲醇，涡旋1 min，12 000 r/min离心10 min，氮气吹干，加50 ?L甲醇复溶，涡旋1 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液20 ?L，采用HPLC测定芹菜素含量，记录峰面积。芹菜素的细胞内摄取量以?g（药物）/mg（蛋白）表示[6]。

2.3.3 影响因素考察

细胞培养14 d，吸去培养液，用HBSS清洗3次，每孔加入含药的HBSS溶液1 mL，分别考察培养时间、浓度、温度、pH值及P-糖蛋白（P-gp）抑制剂维拉帕米和环孢素A对芹菜素摄取的影响。

2.3.3.1 时间对Caco-2细胞摄取的影响

取20 ?g/mL芹菜素的HBSS供试液与Caco-2细胞在37 ℃培养箱中分别孵育0、10、30、60、90、120、180、210、270 min，计算摄取量，结果见图3。可见，芹菜素在Caco-2细胞中的摄取量在0～180 min范围内随着培养时间的增加而增加，其后摄取量下降。因此，后续实验确定摄取时间为180 min。

2.3.3.2 浓度对Caco-2细胞摄取的影响

取不同浓度芹菜素的HBSS供试液与Caco-2细胞在37 ℃培养箱中孵育180 min，考察不同给药浓度（2、3、6、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）对Caco-2细胞摄取芹菜素的影响，结果见图4。可见，药物浓度在2.00～100.00 ?g/mL范围，细胞摄取速率与药物浓度具有一定的线性关系，符合一级动力学过程，可视为被动扩散，确定细胞摄取浓度在100 ?g/mL以内。

2.3.3.3 温度对Caco-2细胞摄取的影响

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供试液与Caco-2细胞分别在4、25、37 ℃条件下中孵育180 min，考察不同温度对Caco-2细胞摄取芹菜素的影响，结果见图5。可见，在设定的考察温度范围内，芹菜素的细胞摄取量与温度近似呈线性增加。

2.3.3.4 pH值对Caco-2细胞摄取的影响

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供试液与Caco-2细胞分别置于37 ℃，pH 5.00、6.00、7.40、8.00条件下孵育180 min，考察不同pH值对细胞摄取的影响，结果见图6。可见，在pH 5.00～7.40范围内，细胞摄取量持续增加，之后下降，在设定范围内以pH 7.4时药物摄取量最大，后续实验pH值设为7.4。

2.3.3.5 P-糖蛋白抑制剂对Caco-2细胞摄取的影响

取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供试液，分别加入P-gp抑制剂维拉帕米和环孢素A，在pH 7.40、37 ℃环境中孵育180 min，考察P-gp抑制剂对Caco-2细胞摄取芹菜素的影响，结果见表2。可见，加入P-gp抑制剂维拉帕米和环孢素A后，Caco-2细胞对芹菜素摄取量降低（P<0.05）。

3 讨论

新疆维药材芹菜根是伞形科植物旱芹Apium graveolens L.的干燥根，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》[7]和《维吾尔药材标准》[8]，具有明确的护肝、降压及调脂作用[9-12]。芹菜素是芹菜根的主要药效成分[13]，其体内吸收特性研究可为其剂型设计提供药动学依据。

Caco-2细胞来源于人的结肠癌细胞，具有小肠微绒毛结构，可以表达多种药物载体和酶，被广泛用于药物吸收机制的研究。本试验采用Caco-2细胞模型研究芹菜素的摄取特性，以MTT法考察芹菜素对Caco-2细胞的毒性，表明芹菜素浓度对细胞形态、数量及增殖率存在影响，细胞形态学观察表明摄取实验设定浓度应小于100 ?g/mL，增殖率测定结果表明摄取实验设定浓度应小于200 ?g/mL，可能由于芹菜素是难溶性药物，漂洗不到位，死亡细胞释放残留的酶可能还原了MTT而造成实验的误差，而且细胞形态观察是主观判断实验结果，也会存在一定的误差。因此，低浓度芹菜素对Caco-2细胞无毒性。

芹菜素的摄取量受时间、浓度、pH值、温度的影响，并呈一定的剂量依赖性。在0～180 min其摄取量随时间的增加而增加，180 min后呈下降趋势；在2.00～100 ?g/mL范围内，其摄取量随着给药浓度的增大而增加，并呈一级动力学过程特征，超过100 ?g/mL则下降；当pH<7.4时，其摄取量随着pH值升高而增加，pH>7.4时摄取量下降，表明中性条件下摄取较好，酸性条件下不利于其摄取，芹菜素在小肠中的吸收可能较胃中好；在设定的考察温度范围内，其摄取量随着温度的上升而增加，37 ℃条件下更有利于Caco-2细胞摄取芹菜素。

P-gp是Caco-2细胞中的主要外排蛋白之一，P-gp抑制剂可抑制其外排作用，增加底物浓度。本实验以典型的P-gp抑制剂维拉帕米和环孢素A考察P-gp对芹菜素摄取的影响。当加入维拉帕米和环孢素A后，芹菜素的细胞摄取量降低（P<0.05），表明P-gp未参与其吸收过程，即芹菜素不是P-gp的底物，其摄取量降低的机制需进一步探讨。

参考文献：

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