拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌
殷晓敏++吴琼+金志强
摘 要 在西瓜枯萎病重病园区，从生长正常西瓜根际分离获得一株细菌XG-1。经对峙培养和孢子萌发抑制测定，XG-1对西瓜枯萎病菌菌丝生长、孢子萌发具有良好抑制效果。XG-1明显抑制西瓜枯萎病菌菌丝向四周均匀扩展，抑菌带宽度平均为0.6 cm。XG-1培养液处理病原菌菌丝体和分生孢子培养液后，可使尖孢镰刀菌小型分生孢子由椭圆形致畸膨大数倍后成球形，使病原菌大型分生孢子由镰刀形畸变成葫芦串形，使菌丝体致畸膨大成串珠状，同时使分生孢子在合适的条件下不能萌发或萌发后生长缓慢，产生很短的芽管，而失去侵染力。田间小区试验表明，生防菌灌根处理西瓜苗死亡率为10%，相比对照处理的24.44%，能显著降低植株发病率。结合形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析将XG-1鉴定菌株为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。
关键词 甲基营养型芽孢杆菌 ；西瓜 ；尖孢镰刀菌 ；拮抗
中图分类号 S436.5 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.11.011
Study on rhizospheric microflora of Bacillus methylotrophicus Strain
Antagonistic against Watermelon Fusarium Wilt Disease
YIN Xiaomin1，2） Wu Qiong1，2） JIN Zhiqiang1，2）
（1 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou 570102；
2 Hainan Key Laboratory of Watermelon Genetic Improvement， CATAS， Haikou 570102）
Abstract A biocontrol strain XG-1 was obtained from the soil rhizospheric microflora of healthy watermelon in the field heavily infected with Fusarium oxysporum f. sp. niveum （FON）. XG-1 effectively inhibited mycelium growth and conidia germination via dual-culture amd inhibition test. The dual culture FON with XG-1 resulted in good inhibitive zones of 0.6 cm. Culture supernatant of XG-1 deformed some cells of hyphae and spore to be strings of beads or abnormally spherical spore of pathogens of watermelon. Efficacy of strain XG-1 to control the wilt disease was 10% in pot trials，and significantly reduced the incidence of watermelon seedlings. Strain XG-1 was identified as Bacillus methylotrophicus according to its characteristics in morphology and molecular biology analysis according to morphological， physio-biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis.
Keywords Bacillus Methylotrophicus ； Watermelon ； Fusarium oxysporum f. sp. niveum ； Antagonism
西瓜枯萎病俗稱“死秧病”，由西瓜枯萎尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）侵染引起，是一种顽固性土传病害，病原菌在土壤中可以存活数十年之久[1]。目前尚无有效的防治措施[2]，科研人员正寻求有效的防治途径，其中以微生物为代表的生物防治西瓜枯萎病病害，可以回避化学防治的农药残留污染问题，且病原菌不易产生抗性，已成为土传病害防治中重要且有效防治措施[3]。
已报道的细菌类生防菌有荧光假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌和芽孢杆菌属[3-4]，其抑菌机制主要有营养竞争、生态排斥和对峙拮抗等。这些菌株或直接使用，或分离其有效成分后使用，在生产上均已表现出较好的防效。笔者从西瓜根际分离、筛选到一株对FON有明显拮抗作用的菌株XG-1，该菌株培养发酵液能导致西瓜尖孢镰刀菌分生孢子不能正常萌发，失去致病力，病菌菌丝体畸形膨大从而不能侵染寄主植株。经过分子生物学鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。甲基营养型芽孢杆菌在防治番茄早疫病和稻白叶枯病的研究已有报道[5-7]，而其对西瓜枯萎病菌的生防作用未见报道。现将本研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
XG-1菌株分离于海南省三亚市崖州区发病西瓜地的健康植株根际土壤中；西瓜枯萎病尖孢镰刀菌为本课题组所保存，简写为FON。
1.2 方法
1.2.1 XG-1对FON的平板抑菌带检测
平板对峙测定室内离体条件下拮抗菌株对西瓜尖孢镰刀菌菌丝体生长的抑制[8]。endprint
1.2.2 XG-1发酵液对FON的抑制作用
制备拮抗菌株培养液滤液[9]，将拮抗菌株经斜面活化后，接种一环于内装50 mL NB的500 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min振荡培养48 h后，8 000 r/min离心10 min，取上清液经直径0.22 μm微孔滤膜过滤即为拮抗细菌培养液滤液。
采用悬滴法[9]测定发酵液对FON的抑制作用，稀释病原菌孢子液浓度为1×106 CFU/mL，调整拮抗菌株发酵液OD600为2.0[8]， 分别取50 uL病原菌孢子悬浮液与50 uL不同稀释倍数的XG-1发酵液混合共培养，使XG-1发酵液的最终浓度为50%、25%、10%、5%、3%、0.5%。每处理设3个重复，以无菌水与病原菌孢子悬浮液混合为对照。在28℃下培养，12 h后显微观察病原菌孢子萌发情况，计算孢子萌发率、抑制率，得出其EC50值[9]。
1.2.3 XG-1发酵液对FON的拮抗遗传稳定性测定
将活化后XG-1划线接种于NA固体培养基，28℃培养，每隔24 h转接一次，共转40次。用悬滴法测定转管第1代、10代、20代、30代、35代和40代XG-1发酵液对西瓜尖孢镰刀菌的抑菌作用[10]。以菌液浓度做对数变换，抑制率做概率变换，以浓度对数值Log（C）为自变量，概率单位为变量的回归直线散点图，概率对数变换后进行的毒力回归计算[11]。计算转管40代后，经XG-1培养液滤液处理12 h后西瓜枯萎病菌孢子萌发率以及由此得出的毒力曲线和EC50。
1.2.4 XG-1对FON的小区防治试验
对西瓜苗小区防治试验设3个处理：（A）XG-1发酵液稀释50倍灌根；（B）15%恶霉灵水剂600倍液灌根；（C）10%噻唑膦微乳剂1 000倍液；（D）清水对照。每处理及对照设3个重复，每重复为一个小区，30株西瓜苗，4～5片真叶。移栽前及移栽后7 d，对西瓜苗进行灌根处理，移栽后60 d，计算小区西瓜植株的发病死亡率。从各小区发病的西瓜植株根际和长势旺盛的健康植株根际取土样，分析土壤微生物群落数量[12-13]。
1.2.5 XG-1的常规鉴定
参照文献[14]进行亚甲兰染色、革兰氏染色、芽孢染色和其他生理生化指标的测定。根据文献[15-16]进行分类检索表鉴定。
1.2.6 XG-1的分子生物学鉴定
制备拮抗细菌基因组DNA[17]，进行细菌16S rDNA序列比对分析。根据原核微生物16S rDNA保守序列设计引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。引物委托上海英俊生物公司合成。PCR反應体系为25 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物 27f和1492r（25 pmol）各1 μL，dNTP Mix（2.5 μmol/L）0.5μl，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，DNA模板30～50 ng。PCR扩增反应条件：95℃ 1 min，55℃ 40 s，72℃ 2 min，共30循环，然后72℃保持7 min。PCR产物委托生物公司直接进行双向引物测序。利用BLAST软件将获得的基因序列进行序列分析，并于GenBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较。采用DNA Star中的Phylogenetic Tree建菌株系统发育树。
2 结果与分析
2.1 XG-1对FON的拮抗作用测定
平板对峙培养7 d后，XG-1明显抑制西瓜枯萎病菌菌丝向四周均匀扩展，抑菌带宽度平均为0.6 cm（图1-b）。对照病原真菌菌落铺展平板呈圆形扩展，气生菌丝体为白色至淡紫色棉絮状，稀疏（图1-a）。
XG-1菌株发酵液对病菌孢子萌发的抑制作用测定表明，经浓度为50%的XG-1发酵液处理12 h，对孢子萌发的抑制率可以达到99.8%，25%和10%的XG-1发酵液对孢子萌发抑制率分别为97.6%和70.3%以上。结合显微观察，可以看到使尖孢镰刀菌小型分生孢子由椭圆形致畸膨大数倍后成球形（图2），使病原菌大型分生孢子由镰刀形畸变成葫芦串形（图3），使菌丝体致畸膨大成串珠状（图4），同时使分生孢子在合适的条件下不能萌发或萌发后生长缓慢产生很短的芽管，而失去侵染力。对照小型分生孢子长椭圆形（图5），有0～1隔，大型分生孢子镰刀形或纺锤形，有3～5隔，可以正常萌发形成芽管（图6）。
2.2 XG-1对FON拮抗作用的遗传稳定性测定
菌株XG-1从第1代转管到第40代，测定转管后的1代、10代、20代、30代、35代、40代菌株培养滤液对西瓜枯萎病菌拮抗作用的遗传稳定性，结果显示，菌株XG-1转管40代培养液滤液抑制FON的EC50均在4.15%以下，XG-1-1的EC50 2.03%相比XG-1-40下降了2.12%，差异不显著（表1）。
2.3 XG-1处理西瓜植株发病死亡率统计
用生防菌、恶霉灵和噻唑膦三种药剂灌根处理4～5片叶的西瓜苗，60 d后，单株出现了较多的死秧（图7），纵切西瓜茎部维管束变褐色（图8），而健康植株维管束无褐变（图9），以西瓜植株茎叶干枯，且没有果实或果实太小无商品价值，即按西瓜植株死亡计算。调查西瓜发病死亡率，统计结果表明，3种药剂处理后死亡率分别为10%、16.67%和17.78%，相比对照的24.44%低，其中生防菌处理组西瓜苗死亡率与恶霉灵和噻唑膦及对照组西瓜苗死亡率差异显著（表2）。
西瓜定植后60 d，检测发病植株根际和健康植株根际微生物种类和数量，分离结果表明，A、B、C、D 4种处理中只要发病死亡西瓜苗根际土壤中，均可以检测到较高浓度的西瓜枯萎病菌数量（表3），其中以D-对照的为最高，其次为处理C-噻唑膦，达到9.49×102和5.52×102 CFU/g，处理A-健康西瓜苗根系土壤中，尖孢镰刀菌含量也达到2.86×102 CFU/g，与A-生防菌-病株根际土壤中尖孢镰刀菌含量基本相同。各处理植株根际放线菌数量和种类，A-健康植株与其他各处理病株根际放线菌含量差异显著，比A-生防菌-病株的6.61×103 CFU/g高出11倍，比B-恶霉灵-病株的5.29×102 CFU/g高出141.18倍。病株苗根际土壤其他真菌和细菌种类和数量与健康苗相比，差别不明显（表4）。endprint
2.4 XG-1的形态、生理生化鉴定
菌株XG-1在牛肉膏蛋白胨（NB）培养基上形成的菌落为圆形，四周光滑，乳白色，表面有光泽，质地干燥；细胞形状为杆状（图10）；厌氧生长；革兰氏染色呈阳性（图11），具有芽孢（图12）。接触霉测定、脂肪酶反应为阳性；酪蛋白、络氨酸反应为阳性；V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，不能利用柠檬酸盐；能水解淀粉和明胶；菌株接入到2%NaCl的NB培养液中发酵24 h后浑浊。
根据上述菌株XG-1的生物学形态和生理生化特征，结合文献[15-16]进行分类检索表比对，发现该菌株符合芽孢杆菌属的特征范围，将其初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus spp.）。
2.5 XG-1的16S rDNA序列分析
用引物27f和1492r对XG-1基因组DNA的PCR扩增结果得到约1.5 kb的PCR产物。测定结果表明，该序列长度为1 457 bp。由16S rDNA序列结果算出其XG-1 DNA中（G+C）%=55.39%。将该序列进行BLAST和利 Phylogenetic Tree分析软件与下载的同源序列进行比较，构建系统发育树。结果表明：XG-1与枯草芽孢杆菌（HQ662590.1、KT247504.1、KT600022.1、KP184712.1、JF899281.1、KM201258.1）聚为同一个族群，同源性高达99%（图13）。系统发育树显示与Bacillus methylotrophicus strain Mo-Bm-5（HQ662590.1）处在同一个分支，由此可以推断XG-1为芽孢杆菌属。结合形态学和生理生化特征，将XG-1鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus Methylotrophicu）。
3 讨论与结论
在生防菌株直接控制植物的病原菌及其所致病害中，拮抗菌防治植物土传病害应用比较成功，主要源于土传病害病原菌与土壤因子的关系更为密切。利用生防因子在防治西瓜枯萎病上，已有报道。如链霉菌产生的中生霉素能明显引起菌丝细胞内原生质凝集，适合浓度的中生霉素抑制孢子萌发率在100%[18]。农抗120能够提高西瓜幼苗抗枯萎病病原菌毒素致萎的能力，而对病原菌孢子的萌发和菌丝的形态无明显影响[19]。本研究报道的甲基营养型芽孢杆菌，显微明显观察到可使尖孢镰刀菌分生孢子由镰刀形畸变膨大数倍后成球形，使菌丝体致畸膨大成串珠状，这一致畸现象与枯草芽孢杆菌抑制香蕉果实炭疽病分生孢子时，其顶端或中间会产生1个圆球狀泡有些相似之处[20]。且本研究报道的甲基营养型芽孢杆菌在转管40代后，培养液滤液抑制FON孢子悬浮液的EC50值没有明显提高，表现出良好的生防菌株遗传稳定性，表明该菌株具有很大的开发利用价值。
在体外显微观察到生防菌株可以直接作用于病原菌本身使其致畸形外，田间试验结果显示，应用生防菌株XG-1可以改善植株根际土壤微生态，以保证植株其按遗传因子所决定的发育程序健康生长，降低西瓜植株死亡率。鉴于西瓜枯萎病菌可以直接从植株伤口侵入，针对西瓜田土壤线虫比较严重地块，选用杀线虫剂噻唑膦，可以减少线虫危害根系造成伤口数量，在试验设计时，通过噻唑膦减少线虫危害，从而减少枯萎病菌通过伤口侵入根系的机会。结果表明，在各个处理病株和健康植株根际土壤中都分离出大量的枯萎病菌，结合田间发病情况，参考去年该田块发病也比较严重，说明该田块枯萎病菌含量较大，适宜做药剂筛选处理区。关于西瓜苗是否发病，发病植株和健康植株根际土壤的尖孢镰刀菌含量基本相同，为2.86×102和 2.77×102 CFU/g，推测认为，XG-1菌株施入土壤后发挥拮抗作用，推测其可能对土壤生态系统的改善和提高植株本身对病原菌的抵抗力密切相关。结合试验结果，发现健康植株根际土壤的放线菌数量相比病株根际放线菌数量差异显著，据报道多数根际放线菌可以分泌抗生素，或可抑制植物病原微生物的繁殖，基于植株根际土壤微生物能快速对环境变化做出反应，推测植株根际土壤中放线菌数量多少是否与枯萎病的发病有密切关系。
参考文献
[1] Larkin R P， Hopkins D L， Martin F N.Ecology of Fusarium oxysporum f.sp. niveum in soils suppressive and conducive to Fusarium wilt of watermelon[J]. Phytopathology， 1993 ， 83 （10）： 1 097-1 105.
[2] 殷晓敏，陈 弟，郑服丛. 一株对新月弯孢霉等香蕉病原真菌具有良好拮抗作用的菊欧氏杆菌[J]. 热带农业科学，2008，28（3）：38-40.
[3] Kathryne L， Everts， Jennifer C. Himmelstein.Fusarium wilt of watermelon： Towards sustainable management of a re-emerging plant disease[J]. Crop Protection， 2015， 73： 93-99.
[4] HS Wu，XN Yang，JQ Fan.Suppression of Fusarium wilt of watermelon by a bio-organic fertilizer containing combinations of antagonistic microorganisms[J]. BioControl ， 2009， 54（2）： 287-300.
[5] M Madhaiyan， S Poonguzhali， K Soonwo， et al. Bacillus methylotrophicus sp. nov. a novel species of methanol utilizing， plant-growth promoting bacterium isolated from rice[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology. 2010， 60（10）： 2 490-2 495.endprint
[6] 刘利强，杨士玲，陈 强，等. 30亿个/g甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效試验[J]。现代农业科技，2014（9）：130-130.
[7] 吕 倩，胡江春，王 楠，等. 南海深海甲基营养型芽孢杆菌SHB114抗真菌脂肽活性产物的研究[J]。 中国生物防治学报，2014， 30（1）：113-120.
[8] 殷晓敏，陈 弟，吴红萍，等. 一株对香蕉枯萎病菌具有良好拮抗作用的菊欧氏杆菌[J]. 中国生物防治， 2009，29（1）：104-109.
[9] 殷晓敏. 两株香蕉内生细菌的分离鉴定及其对香蕉枯萎病的生防效果评价[C]. 海南大学，硕士论文，2008.
[10] 殷晓敏，陈 弟，吴红萍，等. 香蕉内在拮抗细菌研究Ⅰ——菌株B215的分离及分子鉴定[J]. 热带作物学报，2008，29（5）：636-640.
[11] 裘炯良，颜 艳，郑剑宁. 基于SAS的杀虫剂毒力筛选计算机实现[J]. 中国媒介生物学及控制杂志，2010，21（5）：478-481.
[12] 饶正华. 饲料中细菌CFU统计方法[J]. 饲料博览， 2002（10）：28-29.
[13] 徐 林，黄启星，左 娇，等. 南繁条件下转基因水稻对根际土壤微生物的影响[J]. 生物安全学报，2012， 21（1）：61-66.
[14] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[15] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.
[16] 王金生. 植物病原细菌学[M]. 北京：中国农业出版社，1999.
[17] Ausubel F M， Brent R. 精编分子生物学试验指南[M]. 颜子颖等译. 北京：科学出版社，1998.
[18] 孟祥波，彭殿林. 瓜类枯萎病防治研究进展[J]. 上海蔬菜，2009（6）：10-12.
[19] 刘 波，朱育菁，周涵韬. 农作物枯萎病的研究进展[J]. 厦门大学学报（自然版），2004， 43（s1）：47-58.
[20] 谭志琼，淦国英，张荣意. 枯草芽孢杆菌B68对香蕉果实潜伏炭疽菌的抑制作用[J]. 农业研究与应用，2006（5）：1-4.endprint
