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李玉姬 周煦 裴兴华 黄鹂 雷衍军 张璐璐

[摘要]目的 探討香烟烟雾提取物（CSE）对小鼠C2C12细胞肌肉生长抑制素（myostatin）及炎症介质的影响。方法 不同浓度CSE和（或）myostatin-siRNA刺激和（或）干扰小鼠C2C12细胞后利用MTT检测CSE对细胞生长的影响，根据处理方式不同，实验分为4个组，分别为对照组、5% CSE组、myostatin-siRNA组、5% CSE+myostatin-siRNA组，采用Real-time PCR检测myostatin mRNA表达情况，采用Western blot检测myostatin蛋白表达情况，采用ELISA检测细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）含量。结果 5%以上的CSE处理能显著抑制小鼠C2C12细胞增殖（P<0.05）；5%的CSE处理小鼠C2C12细胞48 h后，myostatin mRNA和蛋白表达明显高于对照组（P<0.05），细胞培养液中IL-8和TNF-α含量明显高于对照组（P<0.05）；siRNA干扰myostatin后再采用CSE处理小鼠C2C12细胞，细胞培养液中IL-8和TNF-α含量明显低于CSE处理组（P<0.05）。结论 CSE上调小鼠C2C12细胞myostatin表达，增加炎症介质释放。

[关键词]慢性阻塞性肺疾病；香烟烟雾提取物；肌肉生长抑制素；炎症介质

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（b）-0004-04

Influence of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells

LI Yu-ji ZHOU Xu PEI Xing-hua HUANG Li LEI Yan-jun ZHANG Lu-lu

The First Department of Critical Care Medicine，Peopel′s Hospital of Hu′nan Province，Changsha 410005，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of cigarette smoke extract on myostatin and inflammatory mediators in mouse C2C12 cells.Methods Different concentrations of CSE and/or myostatin-siRNA stimulated or interference mouse C2C12 cells，and then detected influence of CSE on cell growth by MTT，according to the different treatment methods，the experimental research objects were divided into the control group，5% CSE group，the myostatin-siRNA group，5% CSE+myostatin-siRNA group.Real-time PCR was used to detect the expression of myostatin mRNA，Western blot was used to detect expression of myostatin protein，ELISA was used to detected tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha） and interleukin 8 （IL-8） level in cell culture medium.Results The CSE at the concentration above 5% could significantly inhibit the proliferation of C2C12 cells in mice （P<0.05）.The expression of myostatin mRNA and protein in C2C12 cells treated with 5% CSE was significantly higher than that of the control group after 48 h （P<0.05）.The content of IL-8 and TNF-alpha in the cell culture fluid was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.After siRNA interfered with myostatin，the mouse C2C12 cells were treated with CSE，the content of IL-8 and TNF-alpha in cell culture solution was significantly lower than that in CSE treatment group （P<0.05）.Conclusion CSE can up-regulate the expression of myostatin and increase inflammatory mediators releasing from C2C12 cells.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease；Cigarette smoke extract；Myostatin；Inflammatory mediator

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以进行性气流受限为特点的炎症反应性疾病[1]。吸烟是导致COPD发生的重要因素，香烟烟雾成分能刺激活性氧显著增加并诱导炎症反应[2]。除了肺部异常外，骨骼肌萎缩是最常见的肺外组织改变[3]。前期研究显示，COPD大鼠肌肉生长抑制素（myostatin）含量显著增加，能够促进肌肉萎缩，而骨骼肌萎缩的发生可能与COPD肺部炎症及全身性炎症反应有关[4]。笔者推测香烟烟雾成分升高骨骼肌细胞myostatin含量，引起炎症反应，导致骨骼肌萎缩和功能障碍。本研究采用香烟烟雾处理小鼠C2C12成肌细胞，观察myostatin表达和炎症反应情况，并探讨myostatin在骨骼肌炎症反应中的作用，为COPD骨骼肌萎缩的防治提供新的思路和实验依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

小鼠成肌细胞C2C12细胞（中科院上海细胞库），芙蓉牌香烟（焦油12 mg/支）（湖南中烟工业有限责任公司），DMEM培养基和胎牛血清（Gibco），MTT试剂（Sigma），Lipofectamine 3000和TRIzol（Invitrogen），逆转录试剂盒和Real-time PCR检测试剂盒（Takara），BCA蛋白定量试剂盒（WellBiology），ECL发光液（Pierce），兔抗myostatin多克隆抗体（Proteintech），GAPDH抗体、IL-8和TNF-α ELISA试剂盒（博士德），myostatin siRNA（GCGGATGGCAAGCCCAAATT，吉玛生物）。

1.2方法

1.2.1香烟烟雾提取物制备 参照文献方法并加以改良[5]。将1支芙蓉牌香烟去滤嘴燃烧5 min的烟雾通过注射器连续抽吸溶于10 ml 37℃预热的DMEM中，过滤除菌后作为100%的CSE原液，分别配置1.0%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE工作液，1 h内用于实验。

1.2.2 MTT检测 以5000个细胞/孔接种于96孔板，分别给予0.1%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE处理48 h，每组6个复孔，依照MTT说明书进行操作，检测不同浓度CSE处理后C2C12细胞生长情况。

1.2.3细胞干预和分组 以105个细胞/孔接种于24孔板，实验分为4个组，分别为对照组、5% CSE组、myostatin-siRNA组、5% CSE+myostatin-siRNA组。处理48 h，每组6个复孔，收集细胞上清用于ELISA分析，收集细胞用于mRNA或蛋白表达分析。

1.2.4 Real-time PCR检测 C2C12细胞按照TRIzol法提取总RNA，依照试剂盒操作逆转成cDNA。使用ABI7500实时荧光定量PCR进行PCR扩增，引物序列见表1。反应体系20 μl，扩增条件为95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40个循环。按照2-ΔΔCT法[6]计算各组myostatin的相对表达量。

1.2.5 Western blot檢测 C2C12细胞按照RIPA裂解法提取总蛋白，BCA试剂盒定量后取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别以myostatin抗体（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶1000）孵育过夜后，二抗（1∶5000）孵育1 h，ECL化学发光显影。

1.2.6 ELISA检测 C2C12细胞上清收集后，通过ELISA方法测定IL-8和TNF-α含量，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。

1.3统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较选用最小显著性差异法（LSD），以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度CSE对小鼠C2C12细胞增殖的影响

CSE处理小鼠C2C12细胞48 h，与对照组吸光值1.21±0.13相比，1.0%和2.5% CSE组平均吸光度值为1.15±0.09和1.11±0.15，无明显变化，细胞增殖无明显影响（P>0.05）；5%和10% CSE平均吸光度均为0.92±0.17，明显降低，细胞增殖被明显抑制（P<0.05）（图1）。后续实验选用5% CSE进行处理。

2.2各组细胞myostatin mRNA的表达水平分析

Real-time PCR检测结果显示，5% CSE组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为1.32±0.15，显著高于对照组的1.00（P<0.05）；myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.61±0.19，低于对照组（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.92±0.13，低于5% CSE组（P<0.05）（图2）。

2.3各组细胞myostatin 蛋白的表达水平分析

Western blot检测结果显示，5% CSE组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为1.40±0.11，显著高于对照组的1.00（P<0.05），myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.52±0.17，低于对照组（P<0.05），5% CSE+myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.93±0.15，低于5% CSE组（P<0.05）（图3）。

2.4各组细胞炎症介质表达水平

ELISA检测结果显示，5% CSE组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为835.83±47.30和218.83±27.09，显著高于对照组（P<0.05）；myostatin-siRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为510.17±49.15和110.67±12.60，与对照组比较差异无统计学意义（P<0.05）；5% CSE+myostatin-siRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为709.83±111.75与162.17±23.52，低于5% CSE组（P<0.05）（图4）。

3讨论

目前，COPD已经成为全球第四大致死性疾病，每年受COPD困扰的患者多达6亿。全球30岁以上人群中，COPD的患病率从1990年的10.7%上升到2010年的11.7%[7]。2013年全球疾病负担（GBD 2013）报告指出，COPD导致的死亡人数从1990年的242.13万上升至2013年的293.12万，约占全球死亡人数的6%，成为全球第三大致死性疾病[8]。在发达国家，COPD是增长最为迅速的死因之一，在心脑血管疾病病死率大幅下降的同时，COPD的死亡率却增加了163%[9]。随着发展中国家吸烟率的增加和高收入国家的老龄化，COPD的发病率预计在未来30年内将上升，预计到2030年将有超过450万人死于COPD和相关疾病，死亡人数将接近全球死亡总数的8.5%，成为全球第3位死因疾病。近年来，我国COPD发病率呈上升趋势。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》指出，我国40岁及以上人群中COPD患病率为9.9%。张荣葆等[10]针对中国已发表的19项COPD大型流行病学调查资料（2000年1月～2011年12月）分析后，发现中国各地40岁以上人群COPD患病率为6.0%～15.4%。

吸烟是COPD发生、发展过程中最重要的危险因素，香烟烟雾成分能导致肺部乃至全身异常的炎症反应，引起肺癌组织如骨骼肌、心血管等病变，加重COPD的进展[11]。骨骼肌是COPD受累最主要的肺外组织，研究显示，吸烟能导致蛋白合成减少和降解增多，从而导致骨骼肌消耗[12]。此外，香烟烟雾成分能使肺部产生过多的炎症介质（如IL-8和TNF-α）并释放到循环中，参与骨骼肌萎缩的发生[13]。在骨骼肌的消耗及功能障碍过程中，肌肉生长抑制素受到广泛关注，其主要作用为抑制肌肉的生长发育，在肌肉消耗性疾病中表达增高[14]。前期研究已证实，COPD大鼠myostatin含量显著增加，而其在骨骼肌炎症中的作用如何尚未查见相关文献报道。

本研究结果显示，CSE处理小鼠成肌细胞C2C12后细胞myostatin表达增加，炎症介质释放增多；而用myostatin-siRNA沉默myostatin基因后再用CSE处理细胞，myostatin表达增加程度受到抑制，炎症介质释放减少。这提示CSE处理能诱导myostatin表达，沉默myostatin基因后，CSE促进炎症介质释放的作用受到限制，而单纯的myostatin基因沉默并不影响细胞炎症介质的释放，提示myostatin并不直接参与炎症反应的上游调控，而在CSE刺激后，抑制myostatin能够反馈性的减少CSE所致的炎症反應，因此，CSE可导致myostatin水平升高，骨骼肌消耗和萎缩，炎症反应加重，与COPD呈正相关。myostatin沉默后，骨骼肌消耗和萎缩减少，能够对抗CSE所致的炎症反应，缓解COPD[15]。香烟烟雾成分诱导炎症介质产生后，可以通过促进蛋白分解和抑制蛋白合成来诱导骨骼肌消耗[16]，同时活化p38和ERK的MAPK信号，应用p38和ERK的抑制剂能够消除肌肉萎缩和肌球蛋白降解[17]，而吸烟者肌肉蛋白合成降低主要与myostatin表达增加有关，myostatin通过抑制Akt的活化，阻碍蛋白合成的启动和细胞更新而抑制肌肉生长[18]，同时香烟烟雾成分能减低肌肉中活化的Akt，并损害肌肉细胞的分化能力[19]。早期研究显示，COPD患者的运动功能受限主要归因于其肺功能受损，而近年来的研究发现，许多肺功能受损不明显的患者也存在运动功能异常[20]，而干预myostatin来改善骨骼肌功能障碍对于更好地防治COPD炎症反应和疾病演变，改善预后，提高生活质量可能有着重要的价值。

综上所述，通过小鼠C2C12成肌细胞体外培养模型，观察香烟烟雾提取物对myostatin表达和炎症反应的影响，并通过沉默myostatin表达观察炎症反应的改变，并将myostatin作为研究重点，为COPD骨骼肌萎缩和炎症反应的防治提供新的思路和实验依据。

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（收稿日期：2017-08-29 本文編辑：祁海文）