死亡笔记finger套装,好像是第二版的 夜神月吧
张鹏 张鹏飞 高琛
【摘要】 目的 研究脐带间充质干细胞源条件培养基（CM）对氧-葡萄糖剥夺（OGD）诱导皮层神经元死亡的保护作用。方法 培养 10 d的皮层神经元更换培养基为 EBSS平衡盐溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培养箱内孵育， 4 h后恢复正常条件培养， 同时更换为条件培养基作用20 h，
用Hoechst33342 / PI 的染色方法检测其死亡情况。结果 原代培养的 UCMSCs 传至第三代时， 细胞形态为长梭形的纤维状， 折光性好;在培养的皮层神经元建立OGD模型， Control组细胞死亡率为（5.85%±0.41）%， OGD组细胞死亡率（35.6%±1.75）%， Control组与OGD组比较差异有统计学意义（P<0.01）， OGD模型建立成功;复氧0 h时给予脐带间充质干细胞源条件培养基， 作用24 h后， OGD+CM组细胞死亡率为（27.98±2.19）%， OGD+CM组与OGD组比较差异有统计学意義（P<0.05）， CM可使皮层神经元的死亡率降低21.40%。结论 脐带间充质干细胞源条件培养基对氧-葡萄糖剥夺诱导皮层神经元具有保护作用。
【关键词】 氧-葡萄糖剥夺模型;间充质干细胞;条件培养基;皮层神经元
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.12.120
缺血性脑卒中是因各种原因导致大脑供血不足， 从而引起脑组织坏死的总称， 具有发病率高、致死率高和致残率高的特点。氧-葡萄糖剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性脑卒中的体外模型， 能够在体外很好的模拟脑卒中的病理状态。
脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）来源于中胚层间充质的成体干细胞， 具有易于获取， 无伦理学争议， 增殖能力较强， 易于体内外扩增等特性， 成为临床干细胞移植的重点关注对象， 然而无论通过何种途径输入体内， 到达靶器官的细胞数量、状态及存活时间尚无足够的研究证实， 而间充质干细胞在培养过程中发现其可通过旁分泌途径分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等大量生物活性物质[1， 2]， 近年亦有研究报道间充质干细胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可参与细胞间传递、细胞内信号传导以及在体内短距离或长距离运输以改变细胞或组织的代谢[3]， 因此， 尝试使用脐带间充质干细胞来源的条件培养基（Condition Medium， CM）进行研究， 观察其保护神经元的作用。
目前应用细胞模型研究条件培养基保护OGD中神经元死亡的相关研究较少， 本实验制备脐带间充质干细胞来源条件培养基， 其中含有脐带间充质干细胞分泌的大量细胞因子成份， 在体外细胞培养模型中研究其对神经元的保护作用， 从而为缺血性脑血管病的临床治疗提供新的思路和实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 脐带间充质干细胞的原代培养与条件培养基的获取
UCMSCs的原代分离培养：将无菌条件下获取的脐带组织用无菌磷酸缓冲液（PBS）冲洗多次， 至无血迹残留;仔细剔除脐带内血管与表面组织;将组织剪碎， 加入Ⅳ型胶原酶，
37℃消化17～20 h， 期间不时摇晃;再用40 ?m筛网过滤， 去除较大组织块;2000 r/min， 离心5 min， 弃去上清， 将沉淀用无菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 离心5 min， 接种。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬离心管中的细胞， 镜下细胞计数， 使细胞密度达到1×106个/ml， CO2培养箱培养， 换液， 将脐带间充质干细胞不断传代、纯化， 得到UCMSCs。
UCMSC-CM的收集：纯化后的UCMSCs， 收集每次换液的培养基， 经1500 r/min离心去除细胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。
1. 2 Elisa检测条件培养基中细胞因子 向96孔板加入100 μl 1×稀释液， 作为阴性对照。同时加入所测因子的标准品100 μl到96孔板， 然后将所测样品100 μl加到96孔板， 每个样品2个微孔， 室温下避光孵育2 h。孵育结束后向每个微孔加入200 μl酶标检测抗体， 室温下孵育2 h。然后用400 μl l×冲洗液洗涤， 最后加入200 μl显色底物（显色剂A和显色剂B各100 μl）， 室温下孵育30 min， 然后加入50 μl终止液， 用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值）， 通过标准曲线计算样品中生长因子的含量。计算神经营养因子（BDNF）、胰岛素样生长因子-I（IGF-1）、VEGF、bFGF、转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素-6（IL-6）的浓度。每个样品重复4次， 每组取3个样品。
1. 3 OGD的构建 取培养至10 d的皮层神经元， 用无糖EBSS漂洗 1 次， 将细胞培养基置换为无糖EBSS， 原培养液留至复氧后继续使用。于缺氧孵箱（ 94% N2， 1% O2， 5% CO2， 37℃）缺氧 4 h后更换为正常培养基复氧， 继续培养20 h进行检测。
1. 4 皮层神经元死亡的检测 向OGD成功后的皮层神经元培养液内直接加入 Hoechst33342（sigma， 10 μg/ml）， 37℃作用 10 min， 再加入PI（sigma， 5 μg/ml） 37℃作用5 min ， 在荧光显微镜下观察细胞死亡情况并拍照计数。Hoechst33342 标记活细胞及凋亡早期的细胞， PI标记的为坏死细胞及凋亡晚期细胞， 细胞死亡率= PI 阳性细胞数/总细胞数×100%。
1. 5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 原代培养的UCMSC-CM中细胞因子含量的检测结果
原代培养的UCMSCs 传至第三代时， 细胞形态为长梭形的纤维状， 折光性好。见图1。用Elisa法测定CM内多种细胞因子BDNF、IGF-1、VEGF、bFGF、TGF-β、HGF、IL-6的含量。见表1。从检测结果来看， CM中含丰富的BDNF
（220.68±16.80）pg/ml、IGF-1（14.71±1.12）pg/ml、bFGF（16.27±2.89）pg/ml、VEGF（68.53±1.85）pg/ml、TGF-β（73.56±5.59）pg/ml、HGF（116.05±3.32）pg/ml、IL-6（89.48±6.27）pg/ml等多种细胞因子。
2. 2 条件培养基对OGD的皮层神经元死亡的影响 在培养的皮层神经元建立OGD 模型。见图2。Control组细胞死亡率为（5.85±0.41）%， OGD 组细胞死亡率为（35.6±1.75）%。Control组与OGD组比较差异有统计学意义（P<0.01）， OGD模型建立成功。复氧0 h时给予脐带间充质干细胞源条件培养基， 作用24 h后， 与OGD组进行比较， OGD+CM组细胞死亡率为（27.98±2.19）%， OGD+CM组与 OGD组比较差异有统计学意义（P<0.05）， CM可使皮层神经元的死亡率降低21.40%。
3 讨论
随着缺血性脑卒中发病率越来越高， 給人类健康带来了严重威胁， 迫切需要新的有效治疗手段的出现。间充质干细胞由于其体外易于获取， 无伦理学争议， 增殖能力较强， 易于体内外扩增等特性， 常被用于细胞移植的临床试验， 目前可从www.clinicaltrials.gov网站上查询到的使用间充质干细胞的临床试验有600余例。大量动物实验表明， 间充质干细胞可用于治疗基于动物模型的多种疾病， 并具有很好的安全性， 间充质干细胞通过释放多种细胞因子促进内源性神经、血管的再生， 促进突触联系、髓鞘的再生， 并可抑制细胞凋亡， 调节炎症反应[4-6]。既往对间充质干细胞的研究侧重于细胞的分化替代功能， 很少关注其旁分泌现象， 本实验选用间充质干细胞源的条件培养基作用于OGD模型中的皮层神经元， 观察其对神经元的保护作用， 以此证实条件培养基对缺血性脑卒中的治疗作用， 具有一定的创新性。
大量研究报道间充质源条件培养基对疾病模型具有与MSC类似的作用， Markovic等[7]认为MSC-CM通过抑制免疫细胞的介入从而减轻顺铂诱导的肾毒性;Shen等[8]通过大量体内外实验研究， 表明UCMSC可分泌多种可溶性的细胞因子与趋化因子至CM中， 增强CXCR4或CCR2阳性细胞的迁移与血管形成能力;Li等[9]认为MSC-CM可明显改善角质形成细胞的增殖与迁移能力。缺血性脑卒中发生时， 由于血供突然中断， 氧气、葡萄糖供给急剧下降， 使该部位脑组织崩解破坏， 兴奋性氨基酸大量释放， 神经元内钙超载， 导致神经元损伤;同时， 自由基的大量产生以及与凋亡相关基因的表达和炎症反应的发生， 进一步加剧神经元的损伤[10-13]。
本研究中， 运用预存的神经元培养液和适量的新鲜培养液为神经元复氧， 谷氨酸大量产生， 给予间充质干细胞源的CM后， 细胞死亡率明显下降， 表明CM对OGD模型中的皮层神经元具有显著的保护作用， 而CM中经检测含有大量的活性细胞因子， 提示CM可能通过多种活性因子的作用减轻神经元在缺血缺氧性环境中受到一系列损伤[14， 15]。当然， 其具体的作用机制仍须进一步的实验进行验证。
综上所述， 脐带间充质干细胞源条件培养基对OGD模型中的皮层神经元具有显著的保护作用， 这可能与CM 中含有多种细胞活性因子发挥保护作用有关。
参考文献
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[收稿日期：2017-12-29]
