左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马Bcl 2,Bax,Caspase 8蛋白...
杨蕙++王宇红++杜青++韩远山++孟盼++刘检++刘林++赵洪庆
摘要：目的 研究左歸降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马星形胶质细胞神经营养功能的保护作用。方法 采用复合方法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。实验大鼠随机分为模型组、阳性药组和左归降糖解郁方高、中、低剂量组，每组12只，另取12只SD大鼠作为正常组。各给药组给予相应药物灌胃，连续4周。旷场实验检测大鼠抑郁行为，免疫组化检测大鼠海马星形胶质细胞标记物特异性蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及神经元细胞标记物微管相关蛋白2（MAP2）的表达，Western blot和RT-PCR检测大鼠海马星形胶质细胞营养分泌物脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠活动次数明显减少，海马GFAP表达明显增加，MAP2、BDNF、GDNF、NGF表达明显减少；左归降糖解郁方干预后，模型大鼠抑郁行为明显改善，大鼠海马BDNF、GDNF、NGF、MAP2表达增加，GFAP表达明显减少。结论 左归降糖解郁方可有效改善大鼠海马星形胶质细胞的分泌功能，其可能通过增强星形胶质细胞的营养作用保护神经元，从而发挥抗抑郁作用。
关键词：左归降糖解郁方；糖尿病并发抑郁症；星形胶质细胞；神经营养；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）09-0043-05
Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on Neurotrophic Effects of Astrocytes in Diabetes Mellitus Rats with Depression YANG Hui1， WANG Yu-hong2， DU Qing2， HAN Yuan-shan1， MENG Pan2， LIU Jian1， LIU Lin1， ZHAO Hong-qing1 （1. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410007， China）
Abstract： Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on neurotrophic effects of astrocytes in diabetes mellitus rats with depression. Methods The diabetes mellitus with depression rat models were established by composite method， and then were randomly divided into 5 groups： model group， positive group， Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription high-， medium-， low-dose groups， with 12 rats in each group. 12 normal rats were set as control group. Each administration group was given relevenat medicine for gavage for continuous 4 weeks. Open-field test was used to evaluate the depression-like behavior. The expression of GFAP in astrocyte and MAP2 in neuron were tested by immunohistochemistry. The expression of protein and mRNA of BDNF， GDNF， and NGF were tested by Western blot and RT-PCR. Results Compared with the control group， the activities of rats in model group were significantly reduced. The expression of GFAP increased， while the expressions of MAP2， BDNF， GDNF and NGF decreased. Compared with the model group， the depression-like behavior of rats in model group were significantly improved. The expression of GFAP decreased， while the expressions of MAP2， BDNF， GDNF and NGF increased， and GFAP decrseaed significantly. Conclusion The secretion function of astrocyte can be improved by Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription. Its anti-depression and neuron-protection function might be correlated with the enhancement of neurotrophic effects of astrocytes.
Key words： Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription； diabetes mellitus with depression； astrocyte； neurotrophy； rats
基金项目：国家自然科学基金（81403379、81373578、81573965、81603604）；湖南省自然科学基金（2016JJ4064）
通讯作者：王宇红，E-mail：philomena_yh@sina.com
研究发现，糖尿病并发抑郁症占糖尿病患者比例高达38.35%，其中轻度抑郁症为26%，中度为9.6%，中重度为2.9%，重度为0.7%[1]。目前治疗用药较少、研发滞后，与高患病率形成了鲜明对比。左归降糖解郁方是在左归丸基础上加减而得，课题组前期研究发现，其可有效降低糖尿病并发抑郁症模型大鼠血糖，改善胰岛素抵抗；行为学研究发现，其可增加大鼠的不动行为，增强学习记忆能力；形态学研究结果表明，模型大鼠海马病理损伤在给药后显著减轻[2-4]。此外，课题组还发现，左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马星形胶质细胞同样具有保护作用[5]。星形胶质细胞是中枢神经系统内比重较大的一类胶质细胞，在神经元的整个发育过程中起重要作用。目前针对糖尿病并发抑郁症的研究多集中于对高糖、胰岛素抵抗、神经元功能可塑性等方面展开，较少有星形胶质细胞在其中的重要作用的研究。左归降糖解郁方是否通过影响星形胶质细胞-神经元相互作用保护神经元，进而发挥抗抑郁的作用，尚未见报道。本实验以星形胶质细胞的神经营养作用为主，采用免疫组化、Western blot、RT-PCR检测星形胶质细胞和神经元的标记物及海马星形胶质细胞的3种分泌物脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）的表达，初步研究左归降糖解郁方对星形胶质细胞分泌功能的影响及对神经元的保护作用。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠72只，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于湖南中医药大学SPF级动物房，温度20～24 ℃、相对湿度40%～60%，自由摄食饮水，实验前适应性饲养3 d。
1.2 药物
左归降糖解郁方（黄芪18 g，贯叶连翘3 g，姜黄9 g，熟地黄15 g，山萸肉12 g，枸杞子12 g，菟丝子9 g，杜仲9 g，丹参12 g，牡丹皮6 g，牛膝9 g），上述饮片购自本院中药房，由制剂室煎制；盐酸二甲双胍片，湖南湘雅制药有限公司，批号150123；盐酸氟西汀胶囊，法国Patheon，批号SS41A。
1.3 主要试剂与仪器
链脲佐菌素（STZ，Solarbio），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德有限公司），BDNF、GDNF、NGF兔抗大鼠多克隆抗体（abcom公司）；即用型SABC-AP试剂盒和Western用二抗IgG-HRP（武汉博士德有限公司）。Open-field敞箱（美国东乐自然基因生命科学公司），mini protean 3 cell型电泳仪（BIO-RAD公司），PS-9型电转仪（大连竞迈科技有限公司），PCR仪（BIO-RAD公司），Olympus生物显微镜（日本OLYMPUS公司），DVP-W7显微镜图像处理系统（南京长城信息系统公司）。
2 实验方法
2.1 造模、分组及给药
采用高脂灌胃/STZ/慢性应激方法建立糖尿病并发抑郁症动物模型[6]。实验大鼠随机分为模型组、阳性药组（二甲双胍0.18 g/kg+氟西汀1.8 mg/kg）和左归降糖解郁方高、中、低剂量组（20.53、10.26、5.13 g/kg），每组12只，另取12只SD大鼠作為正常组。阳性药组大鼠予二甲双胍18 mg/mL和氟西汀0.18 mg/mL，左归降糖解郁方高、中、低剂量组大鼠分别予2.053、1.026、5.13 g/mL左归降糖解郁方水煎液，正常组和模型组给予等量蒸馏水。各组大鼠给药体积均为10 mL/kg，连续28 d。
2.2 样本采集与处理
各组大鼠采用水合氯醛麻醉后，取6只用于免疫组化实验，另6只做PCR和Western blot实验。免疫组化样本处理方法：处死大鼠，打开胸腔，从心尖入针，剪开心耳，4%多聚甲醛进行灌注，用以固定蛋白及冲去脑中血液，取全脑并浸泡于4%多聚甲醛中。PCR和Western blot样本处理方法：处死大鼠并于冰台上迅速取出全脑，剥离海马，一分为二，液氮冻存。
2.3 指标检测
2.3.1 旷场实验 长100 cm×宽100 cm敞箱底部划分25个面积相等方格。实验时保证环境光线昏暗，大鼠适应1.5 min后，记录大鼠3 min内敞箱中活动情况。四爪每次全部经过方格则水平活动次数加1，前两爪每次腾空或攀附在箱壁上则垂直活动次数加1。实验结束后，分别对各组大鼠在水平和垂直方向上的得分进行统计。
2.3.2 免疫组化检测 固定好的大鼠全脑冲洗后，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡并包埋形成蜡块。切片后，脱蜡，水化，并做抗原修复，随后染色。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体，分别滴加兔抗大鼠GFAP（1∶400）和MAP2抗体（1∶400），4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，加入辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，室温孵育后PBS漂洗。滴加SABC，室温孵育30 min，PBS洗3次。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。采用图像分析系统采集图像分析海马MAP2和GFAP的染色平均光密度值。
2.3.3 Western blot检测 取大鼠海马加入预冷的裂解液并于冰上匀浆，4 ℃、12000 r/min离心20 min。测定总蛋白含量，并取等量蛋白质电泳分离，分离后移至PVDF膜，封闭2 h，TTBS洗3次×5 min，4 ℃孵育过夜，TTBS洗3次×5 min，加入二抗孵育2 h。采用ECL化学发光法进行检测。
2.3.4 RT-PCR检测 取大鼠海马按50～100 mg组织/1 mL Trizol加入Trizol，搅碎，静置；按200 μL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿，室温放置5 min；低温离心15 min取上清液，加入等体积异丙醇，低温高速离心10 min，吸出上层液；按100 μL 75%乙醇/1 mL Trizol比例加入乙醇，悬浮沉淀，低温高速离心5 min，弃上清液，重复1次。干燥5 min，10～25 μL RNasin- free H2O溶解得总RNA。反转录RNA成cDNA，在50 μL cDNA反应液内分别加入2 μL引物（BDNF：5'-GAAACCGTCTAGAGCAATATC-3'，5'-GGTGGAA CTGGATGAAGTACTACC-3'，产物长度142 bp；NGF：5'-CTAAACTTCAGCATTCCCTTGAC-3'，5'-CCCAA CACCATCACCTCCTTG-3'，产物长度153 bp；GDNF：5'-ATTTTATTCAAGCCACCATCAAAAGACTG-3'，5'- CAATAAATATCTTCTCTATATCTCTGTATTTG-3'，产物长度163 bp），RT-PCR反应循环为95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，持续40个循环和60 ℃、30 s。以β-actin基因（5'-GACTACCTCATGAAGATCCTCAC-3'，5'-CT CCTTGATGTCCCGCACG-3'）作为内参，产物长度159 bp。采用2-ΔΔCt方法分析相对基因表达差异。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间各指标比较采用方差分析、t检验和双侧检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 旷场实验结果
与正常组比较，模型组大鼠水平和垂直活动次数显著减少（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠水平和垂直活动次数显著增加（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2表达的影响
正常大鼠海马星形胶质细胞胞体和树突均呈MAP2和GFAP免疫陽性细胞，其胞质呈均匀弥漫性染色，形态呈星形，突起为放射状或星状，长短不一。与正常组比较，模型组神经元MAP2表达明显减弱，GFAP表达显著增加（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马MAP2阳性表达显著增加，GFAP表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2、图1、图2。
4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子和神经生长因子蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠海马BDNF、GDNF、NGF表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方中、高剂量组大鼠海马BDNF、GDNF、NGF表达显著升高（P<0.05，P<0.01））。结果见表3、图3。
4.4 左归降糖解郁方对模型大鼠脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子基因表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠海马BDNF、GDNF、NGF mRNA表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组和阳性药组大鼠BDNF、GDNF、NGF mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01），左归降糖解郁方中剂量组BDNF mRNA表达显著升高（P<0.05）。结果见表4。
5 讨论
左归丸用于治疗糖尿病历史悠久，课题组结合糖尿病并发抑郁症的现代疾病特点，通过加减配伍，得到左归降糖解郁方。实验发现，其可通过降低海马中皮质酮的含量，保护海马神经元，唤醒负反馈调节机制，缓解模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱，进而对糖尿病并发抑郁症大鼠实现整体治疗[7]。
然而，皮质酮不仅损伤海马神经元，同时还会损伤海马星形胶质细胞。糖尿病状态下，皮质酮含量异常升高可加重其对星形胶质细胞的损伤。Moghaddam H K等[8]通过检测星形胶质细胞特异性蛋白GFAP发现，STZ诱导的糖尿病大鼠海马星形胶质细胞异常增生。星形胶质细胞是神经元的环境细胞，其对神经元起到支持、稳定、营养修复神经元等多重作用，同时其还可通过调节神经细胞内、外离子浓度和传递第二信使，摄取、灭活和供给神经递质等作用参与神经元的功能发挥[9]。因此推测，糖尿病状态下，体内皮质酮水平持续升高损伤海马导致抑郁症的发生，可能不仅只与神经元有关，更可能通过损伤海马星形胶质细胞，影响神经元的内环境，导致神经元更加脆弱，损伤亦进一步加重。本实验以GFAP和MAP2分别作为星形胶质细胞和神经元细胞的标记物，免疫组化结果显示，糖尿病并发抑郁症大鼠海马GFAP表达显著增加，MAP2表达显著减少，提示星形胶质细胞存在明显的增生，而海马神经元细胞存在一定程度的损伤。给予左归降糖解郁方后，模型大鼠GFAP表达减少，MAP2表达增加，星形胶质细胞和神经元细胞损伤均有所减轻。
神经营养是星形胶质细胞对神经元的多种作用中极为重要的一种。该作用与星形胶质细胞的分泌功能密切相关。闰荣等[10]通过体外实验发现，星形胶质细胞可通过神经营养作用促进神经元样细胞的分化。糖尿病皮质酮升高是否可通过损伤海马星形胶质细胞影响其分泌功能，通过改变分泌物的含量影响神经元的形态与功能，产生抑郁症值得研究。星形胶质细胞可分泌BDNF、GDNF、NGF等多种神经营养因子。其中，BDNF是神经营养因子家庭中的重要成员，其对神经元具有分化、增殖、营养、成熟的作用，能增强突触联系，影响神经元的可塑性和神经递质、神经营养因子的合成，且与长时程增强效应及学习记忆功能有关[11]。GDNF是转化生长因子β超家族的成员之一，主要来源于星形胶质细胞，对胆碱能神经元、海马神经元存活有营养作用，同时可对抗神经元凋亡，参与糖尿病脑病的发生[12]。而NGF是一类对神经元的分化和突起的生长、存活及功能起支持促进作用的蛋白质，具有促进神经再生和修复的作用[13]。因此，本实验采用BDNF、GDNF、NGF为代表，研究发现，糖尿病并发抑郁症大鼠海马中上述指标含量均明显降低，而给予左归降糖解郁方后含量均显著升高。
综上，本研究结果表明，左归降糖解郁方可能通过有效改善模型大鼠海马星形胶质细胞的分泌功能，保证对神经元的营养供应，保护神经元损伤，进而发挥抗抑郁的作用。
参考文献：
[1] ARSHAD A R， ALVI K Y. Frequency of depression in type 2 diabetes mellitus and an analysis of predictive factors[J]. J Pak Med Assoc，2016，66（4）：425-429.
[2] 王宇红，杨蕙，尹玲桃，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠血糖血脂的影响[J].中草药，2014，45（11）：1602-1606.
[3] 张秀丽，王宇红，杨蕙，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠学习记忆及海马超微结构的影响[J].时珍国医国药，2015，26（4）：787-789.
[4] 王宇红，杨蕙，孟盼，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠行为学及认知功能的影响[J].中国现代应用药学，2014，31（12）：1427- 1431.
[5] 王宇红，谭小雯，赵洪庆，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马星形胶质细胞GFAP、S100B的影响[J].时珍国医国药，2015，26（8）：1808-1811.
[6] 孟盼，赵洪庆，杜青，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（9）：78-81.
[7] WANG Y H， YANG H， LI W， et al. Zuogui Jiangtang Jieyu formulation prevents hyperglycaemia and depression-like behavious in rats by reducing the glucocorticoid level in plasma and hippocampus[J/OL]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2015，2015：158361 [2015-02-01].http：//xueshu.baidu.com/ s？wd=paperuri%3A% 28d10a8e53f8e5b6faedf45990ac1e0e0b%29& filter= sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2Fpmc%2Farticles%2FPMC4530230%2F&ie=utf-8&sc_us=10754268847433207250.
[8] MOGHADDAM H K， BALUCHNEJADMOJARAD T， ROGHANI M， et al. Berberine ameliorate oxidative stress and astrogliosis in the hippocampus of STZ-induced diabetic rats[J]. Mol Neurobiol，2014，49（2）：820- 826.
[9] 莫永炎，姜勇，陳瑗.脑星形胶质细胞生物学功能研究进展[J].生理科学进展，2002，33（1）：71-73.
[10] 闰荣，罗晓光，张尧，等.星形胶质细胞条件培养液诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的神经营养机制探讨[J].中国医科大学学报， 2013，42（8）：714-721.
[11] AYUOB N N， ALI S S， SULIAMAN M， et al. The antidepressant effect of musk in an animal model of depression：a histopathological study[J]. Cell Tissue Res，2016，366，271（2）：271-284.
[12] 陈丽.糖尿病大鼠脑内GDNF和ChAT表达的变化及相关性[D].济南：山东大学，2005.
[13] 段袖珠，段金廒，朱悦，等.开心散配伍比例对慢性应激抑郁小鼠皮层与海马神经营养因子系统调控的影响[J].南京中医药大学学报，2016， 32（2）：142-147.
（收稿日期：2017-01-20）
（修回日期：2017-02-21；编辑：华强）
