花是植物的生殖器,只有人类,才会把一个物种的生殖器摘下来,
刘艳+罗敏+秦民坚+谢国勇+章文伟+陈强+肖波+李娜
摘要：目的 研究多花黃精的生殖生物学特性。方法 在花期定点定株观察记录多花黄精的开花习性，用TTC法检测其开花各时期的花粉活力，采用联苯胺-过氧化氢法检测不同开花时期柱头的可授性，估算杂交指数并计算其花粉胚珠比，通过6种不同的人工授粉方式处理确定多花黄精的繁育系统类型。结果 多花黄精在4月5日左右现蕾，4月10日左右开花，5月上旬陆续开始结实，花期约30～40 d。自花药未开裂时花粉即开始具有活力，花朵枯萎后花粉失去活力，开花当日花粉活力达73.06%±5.19%。自花朵未开放时柱头即具有活性，花朵开始衰败时柱头活性减弱消失。多花黄精的杂交指数为4，据Dafni标准其繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者；其花粉胚珠比为1799.20±445.54，据Cruden标准其繁育系统为兼性异交。人工控制授粉试验结果表明多花黄精具有无融合生殖、自交和异交3种生殖方式，其结实率受外界条件影响较大，总体结实率较低，自然状态下仅为17.46%。结论 多花黄精具有无融合生殖、有性生殖与无性生殖3种生殖方式。
关键词：多花黄精；开花习性；花粉活力；柱头活性；繁育系统
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.017
中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0071-04
Study on Reproductive Biology of Polygonatum cyrtonema Hua LIU Yan1， LUO Min1， QIN Min-jian2， XIE Guo-yong2， ZHANG Wen-wei1， CHEN Qiang1， XIAO Bo1， LI Na1 （1. Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Chongqing Branch Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Chongqing 408435， China； 2. China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）
Abstract： Objective To study the reproductive biology of Chinese herbal medicine Polygonatum cyrtonema Hua. Methods The flowering habit of P. cyrtonema was observed and recorded regularly. The pollen viability at different flowering periods was detected by TTC. The stigma activity at different flowering periods was measured by the benzidine-hydrogen peroxide method. The hybridization index was estimated and pollen-ovule ratio was calculated. The breeding system of P. cyrtonema was determined by six different artificial pollination treatments. Results The flower buds of P. cyrtonema appeared at April 5. They bloomed at April 10 and fruited early in May， flowering about 30–40 days. The pollen began to have viability since the anthers were not cracked， and loss viability after flowers withered. The pollen viability at the bloom day was about 73.06%±5.19%. The stigmas began to have activity before flowers opening and lost it when the flowers began to decline. The hybridization index was 4， so the breeding system of P. cyrtonema Hua was partly self-compatible and xenogamy needing pollinator according to Dafnis standard. The pollen-ovule ratio was 1799.20±445.54， therefore the breeding system of P. cyrtonema Hua was facultative xenogamy according to Crudens standard. The results of artificial pollination experiments showed that P. cyrtonema Hua had three breeding methods， including apomixis， selfing and outcrossing. The fruit setting rate of P. cyrtonema Hua was greatly influenced by external conditions such as strong wind and rain. Generally， P. cyrtonema Hua had a low fruit-set percentage because of obvious flower and fruit dropping. The natural fruit setting rate was only 17.46%. Conclusion The coexistence of apomixes， sexual and asexual reproduction in P. cyrtonema are the survival strategy adapting to different habitat types.endprint
Key words： Polygonatum cyrtonema Hua； flowering habit； pollen viability； stigma activity； breeding system
基金项目：重庆市卫生计生委中医药科技项目（zy201402124、zy201702147）；西部之光訪问学者计划项目（2016年）
通讯作者：章文伟，E-mail：ssf333@126.com
多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua隶属于百合科Liliaceae黄精属Polygonatum，为《中华人民共和国药典》收载黄精的原植物之一。属药食同源植物，为我国传统大宗中药材。其性平，味甘，入脾、肺、肾经。功效养阴润肺、补脾益气、滋肾填精，主治阴虚劳嗽、肺燥咳嗽、脾虚乏力、食少口干、内热消渴、肾亏腰膝酸软、阳痿遗精、耳鸣目暗、须发早白、体虚羸瘦、风癞癣疾。多花黄精为多年生草本植物，生于山林、灌丛、沟谷旁的阴湿肥沃土壤中，分布于我国中南地区及江苏、安徽、浙江、江西、福建、四川、重庆、贵州等地。
目前对多花黄精的研究包括对其生理生态学方面的研究[1-2]、种植技术研究[3-7]、种子繁殖技术研究[8]、分子生物学研究[9]、组培快繁方面的研究[10]等。目前对多花黄精生殖生物学特性以及繁育系统方面的研究报道非常少，田启建等[11-12]研究了栽培多花黄精的物候期及开花结实特性，发现多花黄精蕾期为45 d左右，花期约20 d，结实率为58.37%，落果严重，田间成熟果实量非常小。
多花黄精种子成熟率低，目前在药材生产中多花黄精的栽培主要以无性繁殖为主（依靠地下茎）[2，11]，但是长期的无性繁殖弊端比较大，如品种退化、病虫害发生严重等，使药材产量和质量受到严重影响。本研究着重对多花黄精的花粉活力、柱头活性及繁育系统等进行检测，研究其有性生殖特性及繁育系统特征，为多花黄精在规范化栽培中能尽快解决无性繁殖的弊端、提高有性繁殖的比率提供依据，并为多花黄精后续的种质资源开发提供繁育系统方面的技术参考。
1 材料
试验地位于重庆市南川区三泉镇石门沟，为重庆市药物种植研究所的黄精种质资源圃，栽植面积为360 m2。所用的多花黄精栽种2年，以根茎为繁殖材料，种茎来自湖南省新化县，开花时经重庆市药物种植研究所植物分类学专家刘正宇研究员鉴定为多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua。于2015年4-5月和2016年4-5月进行开花、结实物候观察及人工控制授粉试验等。
2 方法与结果
2.1 开花习性观察
从2015年4月1日开始，每3 d观察1次现蕾情况，现蕾之后，随机选取5株进行标记，观察记录其开花顺序、初花、盛花、末花及结实时间等。同时对即将开放的6朵花蕾挂牌，定位观察并记录花朵个体水平的开花进程。
多花黄精的花蕾与花均按从下往上的顺序生出和开放，花期为4月上旬至5月下旬。2015年4月5日左右开始现蕾，4月10日左右开始开花，单花花期2～2.5 d。花朵于晚上9～10点开始张开，至次日早8点完全张开，持续24 h后开始凋谢，花朵凋谢时花瓣先闭合，1 d后整朵花枯萎。盛花期为4月底至5月初，持续约7～10 d。5月上旬陆续开始结实，有明显的落花落果现象，结实率不高。
2.2 花粉活力及柱头可授性检测
于盛花期随机采集多花黄精开花前后不同大小的新鲜花朵，将少量花粉置于载玻片上，滴1～2滴0.5%TTC溶液，充分混匀后盖上盖玻片，置于35 ℃恒温箱中15 min，之后在显微镜下观察。选取5个视野，每个视野花粉数约为70～100粒，凡被染成红色的花粉为具有活力的花粉，淡红色或无色者为不具有生活力的花粉。花粉活力（%）=红色花粉数÷花粉总数×100%。结果见表1。
采用联苯胺-过氧化氢法检测不同开花时期柱头的可授性。随机选取开花前至开花后不同生长时期的花朵，在凹面载玻片中加入体积比为1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22的反应液，将柱头浸入其中，观察柱头是否呈现蓝色并产生大量气泡。结果见表1。
检测结果显示，多花黄精自花药未开裂时花粉即开始具有活力，经TTC染色后花粉粒呈现红色，花朵枯萎后，花粉失去活力。根据试验结果（见表1），花长0.6 cm以下的花粉不具有活力，花长0.8 cm以上开始具有活力，且随着花朵的逐渐成熟花粉活力逐渐增强，至开花当天花粉活力最高，为73.06%±5.19%，而开花次日至花朵凋谢，花粉活力逐渐下降，开花第2日花粉活力已下降至41.89%±5.10%，远不及开花当日的花粉活力。
多花黄精自花朵未开放时柱头即具有活性，一直延续至开花时，当花朵开始衰败时，柱头活性减弱消失。根据联苯胺-过氧化氢法检测结果（见表1），花长1.3 cm以下的柱头没有可授性，花长1.4 cm以上的柱头才具有可授性，柱头浸入液体中呈现蓝色，柱头周围产生大量气泡。直至开花第3日花朵开始凋谢，柱头活性消失，不再具有可授性。
2.3 杂交指数的估算
按照Dafni的标准[13]进行花朵直径、花朵大小及开花行为的测定及繁育系统的评判。①花朵或花序直径：<1 mm记为0，1～2 mm记为1，>2～6 mm记为2，>6 mm记为3。②花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔：同时或雌蕊先熟记为0；雄蕊先熟记为1。③柱头与花药的空间位置：同一高度记为0；空间分离记为1。以上三者之和为杂交指数（outcrossing index，OCI）。OCI=0时，繁育系统为闭花受精；OCI=1时，繁育系统为专性自交；OCI=2时，繁育系统为兼性自交；OCI=3时，繁育系统为自交亲和，有时需要传粉者；OCI=4时，繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。endprint
多花黄精的花朵直径<6 mm，测量值记为2；雄蕊先熟，花粉在柱头具有可授性之前已经具有活力，测量值记为1；开花时柱头与花药在空间位置上是分离的，柱头位置比花药高约1 mm，测量值记为1。因此，多花黄精的OCI值为4，其繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。
2.4 花粉胚珠比
隨机选取5朵花药未开裂的花。将1朵花中所有的花药置于离心管中，加200 ?L染液，将花药捣碎使花粉散出成为悬浊液，在涡旋仪上震荡60 s，然后用移液枪取5份1 ?L的样本于载玻片上，于显微镜下观察计数，取平均值。1朵花中总的花粉数=1 ?L染液中的花粉数×200。将1朵花的子房在解剖镜下仔细剖开，计数胚珠数。花粉胚珠比（P/O）=花粉数÷胚珠数。根据Cruden的标准[14]进行繁育系统的判断：P/O为2.7～5.4，繁育系统为闭花受精；P/O为18.1～39.0，为专性自交；P/O为31.9～396，为兼性自交；P/O为244.7～2588，为兼性异交；P/O为2108～195 525，为专性异交。
结果多花黄精P/O为1799.20±445.54。依据Cruden的标准可以判断，多花黄精的繁育系统为兼性异交。
2.5 繁育系统检测
于盛花期随机选取花朵，分6个处理进行人工控制授粉试验。①不去雄，不套袋：检测自然状态下授粉情况。②去雄，套袋，不授粉：检测是否具有无融合生殖。③不去雄，套袋：检测是否具有自发的自花授粉。④人工自花授粉：检测自花自交情况。⑤人工同株异花授粉：检测同株异花自交情况。⑥人工异株异花授粉：检测异交情况。
开花前进行去雄操作并用6 cm×8 cm硫酸纸袋将单花套住，开花时完成人工控制授粉试验后继续将单花套住，套袋及授粉用的花朵均选取完整没有开裂的花药。自然对照采用315朵花，其余每处理几十朵花不等。3周后统计结实率，子房膨大者视为结实。结实率（%）=果实数÷花数×100%。结果见表2。
人工控制授粉试验结果显示：去雄、套袋的多花黄精可以结实，结实率为20.00%，说明其存在无融合生殖现象；不去雄、套袋的多花黄精结实率为20.83%，与去雄、套袋的结实率无明显差异，说明缺少传粉媒介辅助时自花花粉对结实率的贡献较小；人工自花授粉、同株异花授粉和异株异花授粉的结实率分别为21.43%、21.05%和23.53%，均略高于去雄、套袋的结实率，说明经过传粉媒介的作用，自花、同株异花、异株异花的花粉均能相应提高结实率。多花黄精具有无融合生殖、自交和异交3种繁殖方式。多花黄精自然授粉状态下的结实率为17.46%，其结实率受外界条件影响较大，大风大雨都会导致严重的落花落果，因此总体而言多花黄精的结实率比较低。
3 讨论
多花黄精的花期约为2个月，单花能开2～2.5 d，盛花期持续约7～10 d，这与田启建等[11-12]对栽培多花黄精的物候期研究结果基本吻合。多花黄精在花长0.8 cm以上时花粉即开始具有活力，开花当日花粉活力达到73.06%±5.19%，一直延续至花朵枯萎后，花粉失去活力。花长1.5 cm以上的柱头具有可授性，当花朵开始衰败时，柱头活性减弱消失。多花黄精的结实率受外界条件影响较大，大风大雨都会导致严重的落花落果，本研究6种人工控制授粉试验中多花黄精的结实率均比较低，约为20%，这与田启建等[11-12]研究得出的“落果严重，田间成熟果实量非常小”的结论一致。本研究中的结实率比该研究发现的多花黄精结实率58.37%要低得多，其原因可以归结为以下几点：①试验地位于重庆市南川区三泉镇，常年风力在2级以上，经常有持续强风，大风加强了落花落果。②试验地的土壤相对干燥，土壤肥力不高。③栽培年限对多花黄精植株的开花数和结实率具有显著影响[11]，试验用多花黄精利用块茎栽种了2～3年，属于低龄，因此造成结实率相对偏低。
多花黄精的杂交指数为4，根据Dafni的判定标准其繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。其花粉胚珠比为1799.20±445.54，据Cruden的标准其繁育系统为兼性异交。这2种方法检测到的繁育系统结果基本一致，也与人工控制授粉试验的结果相吻合，多花黄精具有无融合生殖现象，并且经过传粉媒介的作用，也能进行自交和异交。本研究观察发现，多花黄精的传粉昆虫主要为蜂类，有熊蜂Bombus sp.和淡脉隧蜂Lasioglossum sp.等。加之目前应用最多的地下茎繁殖，多花黄精既存在有性繁殖也存在无性繁殖。有性繁殖与无性繁殖的权衡与生境关系密切，在对典型植物珠芽蓼的研究中发现，在环境恶劣的生境中珠芽蓼减少了投资到营养生长的资源并增加了对繁殖器官的投资，而且对花的资源投资优先于对珠芽的资源投资，表明高山植物在适应极端环境过程中有性繁殖比无性繁殖具有更为重要的作用[15]。无融合生殖是对不良环境的短暂适应，是有性生殖受阻的一种生殖补偿，由于没有外来基因导入，缺乏遗传多样性，在长期的自然选择中会逐渐被淘汰[16]。多花黄精的多种繁殖方式并存，有利于其适应不同的生境类型从而存活下来，确保其种群的繁衍。
多花黄精种子的成熟率低，同时由于其存在较严重的休眠现象，需要2～3年才能出苗，所以目前多花黄精的栽培主要以无性繁殖为主，但长期无性繁殖所导致的品种退化、病虫害严重等问题使药材产量和质量受到严重影响。想破除这些弊端，唯有在实际栽培中加强多花黄精的有性繁殖方式，除了自然的昆虫授粉外，辅助以人工授粉，提高其结实率。同时在实际生产中，针对落花落果问题要加强防护措施，如增加防护网、套种高大农作物等，减少自然环境条件导致的落花落果。本研究为多花黄精的规范化栽培生产及优良种质资源的筛选提供了依据和技术参考，今后将重点关注多花黄精优良品种的选育及如何打破其种子休眠，加快种子萌发并提高发芽率，为中药材市场提供品种优良的高质量种子。
参考文献：endprint
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