应用its2条形码鉴定藏药镰形棘-27.藏鸡产地(或分布):分布于我国的青藏高原. 数量:1983年为17....

豆黄聪++琳郭敏++王晓琳++姜华

摘要：目的 对藏药镰形棘豆及其易混伪品进行分子鉴定，以确保该药材的质量及临床疗效。方法 提取样本基因组DNA，对核基因ITS2片段进行PCR扩增并测序，并对所得序列进行同源性比較，利用MEGA软件进行相关数据分析，并构建基于ITS2序列的邻接（NJ）树。结果 镰形棘豆物种种内K2P遗传距离为0，与其他混伪品的K2P遗传距离分布于0.068～0.084，构建的NJ树表明ITS2序列能够区分镰形棘豆与其他易混伪品。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别镰形棘豆及其易混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。

关键词：镰形棘豆；DNA条形码；ITS2；分子鉴定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019

中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0076-03

镰形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我国青藏高原常用的民间草药之一，收载于1995年颁布的《卫生部药品标准》藏药第一册。全草入药，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎疗效，被誉为藏医“三大抗炎药”之一，是奇正消痛贴膏、青鹏膏剂、流感丸、藏红花油、棘豆扶正胶囊等多种藏药复方或成药的主要药物。王栋等[2]实验研究显示，镰形棘豆具有良好的外周镇痛活性，对急性炎症和慢性炎症都有较好的作用。其黄酮类成分具有抗炎与抗氧化活性[3]。有研究报道，镰形棘豆活性成分对胃癌、肝癌细胞株具有较强的细胞毒

但至目前为止，对藏药镰形棘豆生药鉴定方面的研究还非常薄弱，并且只见于利用传统方法进行鉴定[8]。棘豆属近缘种植物，尤其是同生境分布的近缘种，产地来源相同、表型具有趋同性、形态特征相似，往往很难通过传统的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定等方法进行准确鉴别。因此，本研究提出采用DNA条形码（DNA barcoding）的方法对镰形棘豆及其易混伪品砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等进行分子鉴定。

DNA条形码技术利用短的、标准的DNA序列片段对物种进行分子鉴定[9]。因其是基于物种基因的检测，而不是与环境密切相关的表现型，避免了人为因素和客观条件的影响，为生药鉴定提供了本质依据，适用于对中药材进行真伪鉴定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之间，在物种水平的变异较快，已被用于多个物种的DNA条形码鉴定[11-13]。本研究利用ITS2条形码对镰形棘豆及其易混伪品进行比较研究，旨在为该药材的质量控制、临床安全用药及合理开发利用提供分子依据。

1 仪器与试药

共20个样本，来自7个物种，包括样品及Genbank下载序列。样品由兰州大学生命科学学院副教授盛红梅进行鉴定，凭证标本保存于甘肃省中医药研究院中药研究所。样品及GenBank下载序列见表1。

低温高速离心机（Eppendorf，德国），恒温水浴锅（科哲，中国上海），PCR仪（Bio-Rad，美国），水平电泳仪（Bio-Rad，美国），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。

植物DNA提取试剂盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技术有限公司；定量Marker DS2000，广东东盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 样品总DNA提取

称取100 mg样品组织，在预冷的研钵中进行快速充分研磨，然后利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测后，置4 ℃冰箱保存备用。

2.2 目的序列PCR扩增

ITS2序列扩增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反应体系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司完成测序。

2.3 数据处理与分析

对测序峰图进行校对，去除引物区，使用基于HMM的注释方法[14]，去除两端5.8s和28s区段，获得ITS2间隔区序列。将所有序列用Clustal X软件进行多序列比对，利用MEGA软件分析比对，并基于K2P模型计算序列间进化距离，用邻接（NJ）法构建系统聚类树。利用自展Bootstrap检验评价各分支的支持率，1000次重复。

3 结果

3.1 PCR产物电泳检测

采用ITS2序列引物对采集样本基因组DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结。

3.2 种内与种间变异分析

20个样本的ITS2序列平均长度为211 bp；GC含量差异较小，分布于51.2%～52.8%，平均GC含量为51.8%。K2P遗传距离分析表明，镰形棘豆种内的遗传距离为0，镰形棘豆与其易混伪品种间平均K2P距离为0.075，分布于0.068～0.084。

3.3 聚类分析

基于ITS2序列，利用软件MEGA构建的NJ系统聚类树显示，不同来源的镰形棘豆样本聚为一支，表现出单系性，自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆也分别聚为独立的支，与镰形棘豆区分明显。

4 讨论

由于棘豆属一些物种形态相似，镰形棘豆与相同生境的同属近缘植物难以辨识。棘豆属其他植物如甘肃棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16]，采食有毒棘豆属植物后常会引发动物发生中枢神经抑制、呼吸抑制，引起中毒乃至死亡，或导致动物流产、畸形[17]。伪品混用严重影响真品镰形棘豆的用药安全，因此，对镰形棘豆药材的准确鉴定至关重要。本研究发现，ITS2作为DNA条形码序列，可以有效便捷地鉴别镰形棘豆与砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等易混伪品，具有重要的应用价值。

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（收稿日期：2015-09-09）

（修回日期：2015-11-02；编辑：陈静）