β 榄香烯对人膀胱癌5637细胞凋亡的影响
王秉钧 王先坤 晏波
摘要：目的 观察β-榄香烯对人胰腺癌Panc-1细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。方法 β-榄香烯浓度设置为10、20、40、80、160 μg/mL，作用于体外培养的Panc-1细胞24、48、72 h。台盼蓝拒染法检测Panc-1细胞抑制率；TUNEL法检测Panc-1细胞凋亡；Hoechst33258荧光染色观察Panc-1细胞核变化；ELISA检测Panc-1细胞Caspase-3、8、9活性；Western blot检测Panc-1细胞Fas、FasL、细胞色素C（Cyt c）、凋亡诱导因子（AIF）蛋白表达。结果 与对照组比较，β-榄香烯作用Panc-1细胞24、48、72 h，Panc-1细胞抑制率明显增加（P<0.05，P<0.01），细胞凋亡率明显增加（P<0.01，P<0.001），并呈时间/浓度依赖性；β-榄香烯作用Panc-1细胞72 h，Panc-1细胞核可见明显碎裂，染色质浓缩，呈强蓝色荧光，形成凋亡小体；β-榄香烯作用Panc-1细胞48 h，Caspase-3、8、9活性明显增加（P<0.05，P<0.01），Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表达明显增强（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结论 β-榄香烯能够抑制Panc-1细胞增殖、诱导细胞凋亡，其可能激活细胞内死亡受体途径及线粒体凋亡途径发挥抗肿瘤作用。
关键词：β-榄香烯；胰腺癌；Panc-1细胞；细胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0078-04
Abstract： Objective To investigate the effects of β-Elemene on the apoptosis of human pancreatic cancer Panc-1 cells； To discuss its mechanism of action. Methods β-Elemene （10， 20， 40， 80， 160 μg/mL） were incubated to the Panc-1 cells in vitro cultured for 24 h， 48 h and 72h， and trypan blue refusal method was used to detect cell inhibition rate； Apoptosis rate was measured by TUNEL； Hoechst33258 fluorescent staining was used to observe the changes of the nucleus. The activity of Caspase-3， 8 and 9 were detected by ELISA. Western blot was used to detect the expressions of Fas， FasL and Cyt c and AIF. Results The activity of Panc-1 cells was obviously inhibited time/concentration dependent inhibition （P<0.05， P<0.01）， and the apoptosis rate increased after incubated with β-Elemene （P<0.01， P<0.001） after incubated with β-Elemene for 24 h， 48 h and 72 h； After giving β-Elemene 72 h， Panc-1 cells nucleus were broken obviously， and chromatin condensed and showed strong blue fluorescence， along with of apoptotic bodies； After incubated with β-Elemene for 48 h， Caspase-3， 8 and 9 activity significantly increased （P<0.05， P<0.01）； protein expressions of Fas， FasL， Cyt c and AIF were significantly enhanced （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. Conclusion β-Elemene can inhibit Panc-1 cell proliferation， induce apoptosis， and the mechanism may be related to activating cell death receptor pathway and mitochondrial apoptosis pathway to play anti-tumor effects.
Key words： β-Elemene； pancreatic cancer； Panc-1 cells； cell apoptosis
虽然胰腺癌发病率仅占所有癌症的2.8%，但其侵袭性强、预后差、死亡率高[1]。榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的有效成分。β-榄香烯注射液是由我国自行研发的抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用主要机制包括诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期及放化疗增敏作用、逆转肿瘤细胞多药耐药、抗肿瘤转移、提高机体免疫力等[2]。由于β-榄香烯具有抗肿瘤谱广、作用高效、毒副作用小等特点[3]，临床上已用于胶质瘤、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤的治疗。本实验以胰腺癌Panc-1细胞株为模型，观察β-榄香烯对Panc-1细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人胰腺癌Panc-1细胞株，中国科学院上海细胞库。
1.2 药物
β-榄香烯注射液，大连远大制药有限公司，批号140623-2。
1.3 试剂
10%胎牛血清，DMEM培养基（GIBCO公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）及台盼蓝染色检测试剂盒，碧云天生物研究所；Caspase-活性检测试剂盒，Hoechst33258染色液，武汉博士德生物制品有限公司；抗Fas、FasL、细胞色素C（Cyt c）及凋亡诱导因子（AIF）鼠抗抗体，美国Santa Cruz公司。
1.4 仪器
IX51荧光显微镜（日本Olympus 公司），Spectra Mr型全波长酶标仪（美国DYNEX公司），Z-323高速低温离心机（德国HERMLE公司），EPICS XL流式细胞仪（美国COULTER公司）。
2 实验方法
2.1 细胞培养
Panc-1细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2孵育箱中孵育，常规方法培养细胞。以对数生长期细胞用于实验。
2.2 台盼蓝拒染法检测Panc-1细胞抑制率
实验分为药物组和对照组。当细胞生长至对数期时，弃去旧培养液，37 ℃预热的PBS洗3次，0.25%胰酶消化，以新鲜培养液制细胞悬液，调整细胞密度5×104/孔，接种于96孔培养板，5%CO2、37 ℃细胞孵育箱中培养24 h。弃去培养液，药物组给予含β-榄香烯的新鲜培养液，药物终浓度为10、20、40、80、160 μg/mL。对照组予等体积新鲜培养液，每个浓度设置6个复孔。分别置孵育箱继续培养24、48、72 h。收集细胞，台盼蓝染色5 min，细胞计数板计数，计算细胞抑制率[（1-药物组OD值÷对照组OD值）×100%]。β-榄香烯浓度设置参考文献[4]。所有实验均重复3次。
2.3 TUNEL法检测细胞凋亡率
实验分组、细胞接种及给药方法同“2.2”项。取对数生长期Panc-1细胞接种于12孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，药物组β-榄香烯终浓度为10、20、40、80、160 μg/m，继续培养24、48、72 h，弃去培养液，PBS冲洗3次，0.25%胰酶消化，得细胞悬液，1500 r/min离心5 min，收集细胞，4%多聚甲醛固定1 h，用含0.1%Triton X-100 PBS重悬细胞，冰浴孵育5 min。按照试剂盒说明书采用流式细胞仪进行检测。
2.4 Hoechst33258荧光染色法观察细胞核的变化
实验分组、细胞接种及给药方法同“2.2”项。取对数生长期Panc-1细胞接种于6孔板中，5%CO2、37 ℃孵育24 h，药物组β-榄香烯终浓度为20、40、80 μg/mL的新鲜培养液，继续培养48 h。收集细胞，分散制成细胞悬液。按照Hoechst33258荧光染色说明书进行染色，荧光显微镜下观察细胞核的形态和荧光的强弱，采集图像。
2.5 ELISA检测Caspase-3、8、9酶活性
实验分组、细胞接种及给药方法同“2.2”项。接种于6孔培养板的Panc-1细胞置于37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h，药物组β-榄香烯的终浓度为20、40、80 μg/mL，继续培养48 h。弃去培养液，4 ℃预冷PBS冲洗3次，加入适量裂解液冰浴30 min。细胞刮子刮下细胞，置预冷离心管中，4 ℃、20 000 r/min离心15 min，取上清液存于-80 ℃冰箱保存备用。所测酶活性以Caspase活性增加的百分比表示（药物组OD值÷对照组OD值×100%）。严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.6 Western blot检测Fas、FasL、细胞色素C及凋亡诱导因子蛋白表达
实验分组、细胞接种及给药方法同“2.2”项。细胞加入预冷的适量细胞裂解液（100～150 μL/孔，含蛋白酶抑制剂），冰浴裂解30 min，收集细胞，4 ℃、20 000 r/min离心25 min，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度，-80 ℃冰箱保存备用。10%SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜，一抗Fas、FasL、Cyt c及AIF抗体1∶1000稀释，4 ℃过夜，二抗（1∶1000稀释）室温孵育2 h，ECL法显色。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析及LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 β-榄香烯对Panc-1细胞增殖的影响
不同浓度β-榄香烯作用Panc-1细胞24、48、72 h后，与对照组比较，药物组Panc-1细胞抑制率明显增加（P<0.05，P<0.01），并呈时间-浓度依赖性，两者间无交互作用（P>0.01）。
4.2 β-榄香烯对Panc-1细胞凋亡的影响
不同浓度β-榄香烯作用Panc-1细胞24、48、72 h后，与对照组比较，药物组细胞凋亡率增加（P<0.01，P<0.001），并呈时间-浓度依赖，80、160 μg/mL β-榄香烯诱导作用相同时间细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。
4.3 β-榄香烯对Panc-1细胞核形态的影响
经Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下可见对照组细胞核形态完整，呈弱蓝色荧光；给予榄香烯作用Panc-1细胞72 h后，细胞核可见明显碎裂，染色质浓缩并致密浓染，呈强蓝色荧光，伴有凋亡小体出现。随着药物浓度增大，细胞凋亡发生更加明显。结果见图1。
4.4 β-榄香烯对Panc-1细胞Caspase-3、8、9活性的影响
Caspase-3、8、9均是细胞凋亡过程中关键的Caspase，20、40、80 μg/mL β-榄香烯作用Panc-1细胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均显著增加（P<0.05，P<0.01）。
4.5 β-榄香烯对Panc-1细胞Fas、FasL、细胞色素C及凋亡诱导因子蛋白表达的影响
20、40、80 μg/mL β-榄香烯作用Panc-1细胞48 h后，与对照组比较，Panc-1细胞Fas、FasL、Cyt c及AIF蛋白表达明显增强（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。
5 讨论
由于β-榄香烯广谱、高效、低毒等特点，目前临床上应用于多种恶性肿瘤的治疗。研究表明，β-榄香烯具有直接抗肿瘤作用，体内外均能够抑制肺癌细胞DNA、RNA的合成，从而抑制肿瘤细胞增殖，此作用具有一定的时间和浓度依赖性[5]。毛氏等[6]研究发现，β-榄香烯通过下调人肝癌HepG2细胞内微管蛋白，从而抑制细胞内微管的聚合，发挥增殖抑制作用。本研究发现，不同浓度的β-榄香烯注射液作用Panc-1细胞24、48、72 h后，均有显著的增殖抑制作用。
除抗肿瘤作用外，诱导肿瘤细胞凋亡是β-榄香烯重要的抗肿瘤作用机制之一。有研究发现，β-榄香烯作用于胶质瘤U87细胞后，经流式细胞仪分析，可将细胞周期阻滞于G1/S期，此外Fas和FasL的mRNA和蛋白表达水平上升，表明β-榄香烯通过调节Fas/FasL信号通路抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡。通过TUNEL法检测细胞凋亡实验发现，不同浓度β-榄香烯注射液作用24、48、72 h后能显著诱导Panc-1细胞凋亡；再通过Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察到细胞核碎裂浓染，染色质浓缩，伴有凋亡小体出现。但是，笔者发现，80、160 μg/mL β-榄香烯注射液在作用相同时间时诱导的凋亡率之间无明显差异，可能是β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡的作用与药物浓度并不是简单的线性关系。当药物达到一定浓度时，肿瘤细胞其他死亡方式如坏死增多，β-榄香烯诱导的程序性死亡即凋亡减少[2]。
有研究发现，榄香烯能促进人胃癌SCG-7901细胞凋亡，其机制与调节ERK/P38/MAPK信号通路表达有关[7]；有研究显示，β-榄香烯可能通过调节Fas/FasL信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖并诱导凋亡[8-9]。在哺乳动物细胞内存在2条经典的凋亡途径：死亡受体途径和线粒体凋亡途径。Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，在死亡受体途径中，Fas受体与Fas结合后，Fas受体胞浆区的死亡域发生多聚化使Fas活化，活化的Fas与Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）连接，FADD另一端与无活性的Caspase-8酶原发生交联，从而激活Caspase-8，活化的Caspase-8可以剪切并活化Caspase-3、9及其他Caspase，进而引起随后的级联反应，最终导致了细胞凋亡的发生。
Cyt c是第1种被发现的线粒体释放促凋亡蛋白。线粒体凋亡途径中，Cyt c从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤，这是线粒体外膜通透性增高的结果[10]。释放到细胞浆的Cyt c与凋亡相关因子1结合并将其激活，使其形成多聚体，并促使Caspase-9与其结合形成凋亡小体，Caspase-9被激活，其进一步激活下游的Caspase-3，介导细胞凋亡。本研究发现，20、40、80 μg/mL β-榄香烯作用Panc-1细胞48 h后，Caspase-3、8、9活性均显著增加，Fas、FasL、Cyt c、AIF蛋白表达明显增强，这可能是β-榄香烯诱导Panc-1细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用的机制之一。
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（收稿日期：2015-12-07）
（修回日期：2015-12-30；编辑：华强）
