...脑缺血再灌注后葛根素对海马CA1区Bcl2Bax表达的影响.pdf

李长天　王雅莉　吴国泰　程小丽　舍雅莉　黄勇　陈雁飞

摘要：目的 观察葛根素对去卵巢大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2表达的影响，并探讨其作用机制。方法 将SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组及葛根素高、中、低剂量组，除假手术组外，其余组均行去卵巢手术造模，各给药组给予相应药物腹腔注射，假手术组、模型组给予等生理盐水腹腔注射。采用免疫组化和RT-PCR法，观察去卵巢大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2的表达。结果 葛根素高剂量组大鼠海马CA1区Caspase-3表达明显减少（P<0.05）；葛根素高、中剂量组大鼠海马CA1区Bcl-2表达明显增加（P<0.05，P<0.01），葛根素高剂量组大鼠海马CA1区Bcl-2 mRNA水平明显增加（P<0.05）。结论 葛根素能下调去卵巢大鼠海马CA1区神经元Caspase-3表达，上调Bcl-2表达，对神经元结构异变具有一定的保护作用。

关键词：葛根素；去卵巢大鼠；Caspase-3；Bcl-2；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.03.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）03-0040-03

女性中枢神经元退行性疾病的发生和恶化与雌激素水平的降低乃至缺失有关，临床常用雌激素替代治疗，补充雌激素能有效缓解神经系统症状，但具有增

基金项目：甘肃省自然科学基金（0710RJZA011）

通讯作者：陈雁飞，E-mail：chyanfei@163.com

加乳腺癌和子宫内膜癌等的风险[1-2]。葛根素是一种植物雌激素，具有雌激素样作用[3-4]。前期研究显示，葛根素可增强去卵巢大鼠学习、记忆功能，减轻去卵巢大鼠海马CA1区神经元的凋亡[5]。本研究旨在探讨葛根素对去卵巢大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2表达的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠，雌性，48只，体质量（200±20）g，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物许可证号： SCXK-（甘）-2011-0004。

1.2 药物

葛根素注射液，郑州卓峰制药有限公司生产，每2 mL约含葛根素100 mg，批号0052613；结合雌激素片（商品名：倍美力），爱尔兰惠氏药厂生产，每片含雌二醇0.625 mg，批号0904021。

1.3 主要试剂与仪器

扩增试剂盒（Perfect Real Time）购自TaKaRa公司；Trizol试剂（10296028）购自INVITROGEN公司。Caspase-3单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体、SABC（兔IgG）-POD试剂盒、DAB（3，3'-二氨基联苯胺）试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS，粉剂AR1155）和柠檬酸组织抗原修复液Ⅰ（AR0026），均购自武汉博士德生物工程有限公司；多聚甲醛，天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产，批号20100413；水合氯醛，天津福晨化学试剂厂生产，批号20090201。TISSUE-TEK TEC5组织包埋机，北京怡康勇佳科技有限责任公司；LEICAUCT超薄切片机，德国莱卡公司。

1.4 造模、分组与给药

SD大鼠禁食24 h，禁水8 h，用3%水合氯醛生理盐水溶液麻醉，仰位固定，在大鼠最末肋骨下，距脊椎骨外侧2 cm处，去毛，消毒，纵行切开皮肤1.5 cm，剥开肌肉组织，取出子宫，结扎输卵管，切除卵巢，将子宫角送回腹腔中，施青霉素药粉，缝合切口。同法切除另一侧卵巢。取8只大鼠，取出子宫，暴露卵巢，不切除，再将其放回腹腔，为假手术组。所有大鼠术后给予青霉素（160万U/瓶，每瓶用生理盐水溶至5 mL）腹腔注射，0.2 mL/d，连续注射7 d。除假手术组大鼠外，其余大鼠于术后第7日按体质量随机分为模型组、阳性药组（0.07 mg/kg雌二醇，相当于临床成人日用量10倍）及葛根素高（120 mg/kg）、中（60 mg/kg）、低 （30 mg/kg）剂量组（相当于临床成人日用量的20、10、5倍），每组8只。给药组给予相应药物腹腔注射，假手术组、模型组给予等体积生理盐水腹腔注射。连续30 d。

1.5 取材及标本制作

末次给药24 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪开皮肤，打开胸腔，将4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液500 mL从左心插入导管主动脉灌注，待全身僵硬时，打开颅腔，取出脑组织，分离海马并固定[6]，制作切片，保存于-70 ℃冰箱。

1.6 免疫组化法检测Caspase-3和Bcl-2蛋白表达

按照超敏SP（鼠/兔）试剂盒说明书进行，用PBS替代一抗作阴性对照。用JEM-1230透射电镜观察组织细胞浆出现棕褐色为细胞Caspase-3和Bcl-2阳性染色。每张组织切片中随机选取5个视野（10×10），用BI-2000医学图像分析系统对Caspase-3和Bcl-2表达的灰度进行定量。以灰度值表示图像的透光率，分为256级。平均灰度值越小，说明其免疫组化染色越深，含量越高。

1.7 RT-PCR法检测Caspase-3和Bcl-2基因表达

取液氮冻存的海马组织样品100～120 mg，充分研磨后，加入1 mL Trizol试剂研磨呈匀浆。提取总RNA，反转录出cDNA，利用设计的引物，采取实时荧光定量PCR扩增Bcl-2和Caspase-3基因，反应体系为20 μL（模板2.0 μL，3'上游引物0.4 μL，5'下游引物0.4 μL，PCR Master Mix 10 μL，0.1%DEPC处理水7.2 μL）。反应条件如下：95 ℃变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。扩增β-actin基因引物序列：正向引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，反向引物5'-GACTCA TCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；扩增Bcl-2 cDNA引物：正向引物5'-CTTCCAGACTGAGAGCAACC-3'，反向引物5'-CATCCCAGCCCTCCGTTATCC-3'；扩增Caspase-3 cDNA引物：正向引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAAT G- 3'，反向引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。实验重复3次。endprint

1.8 统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行分析。所有数据用—x±s表示，多组资料均数的比较采用方差分析，组间比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响

免疫组化检测结果显示，Bcl-2和Caspase-3蛋白阳性染色主要为细胞核着色（见图1、图2）。与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组Caspase-3蛋白表达均较模型组降低，其中葛根素高剂量组和阳性药组差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组Bcl-2蛋白表达均升高，其中阳性药组和葛根素高、中剂量组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

2.2 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2基因表达的影响

RT-PCR检测结果显示，与假手术组比较，模型组Caspase-3 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组Caspase-3 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，各组Bcl-2 mRNA表达均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，葛根素高剂量组Bcl-2 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

3 讨论

在神经系统相互作用中，雌激素除了作用于与生殖相关的神经回路外，还作用于与认知功能相关的神经回路——海马回路，从而影响学习和记忆[7]。前期研究表明，葛根素具有雌激素样作用，使海马CA1区神经元凋亡和损伤现象明显减轻[5]。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是目前研究得最清楚的细胞凋亡执行者。可分为启动型和效应型Caspase。Caspase-3属于效应型Caspase，是由28 kD的酶原经酶解作用生成由17 kD和12 kD两个亚单位组成的异二聚体，激活后可导致多种细胞凋亡，在蛋白酶级联切割中处于核心地位[8]。Bcl-2是高等动物中生存和死亡信号至关重要的整合因子之一，也是目前凋亡分子机制研究的主要靶分子，其编码产物Bcl-2蛋白可通过抑制钙离子释放和自由基生成，阻止促凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物，抑制细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，减轻脑组织的损伤[9]。

细胞凋亡信号的转导有死亡受体和线粒体介导的凋亡通路两种，在线粒体介导的凋亡通路中，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放引起的线粒体通透性增大，线粒体内物质向外释放，从而使线粒体跨膜电位明显降低，进而引起的能量代谢障碍是细胞凋亡机制之一。因此，阻止线粒体膜通透性的改变可减轻或防止细胞凋亡。本研究免疫组织化学研究结果表明，与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，表明去卵巢大鼠造模成功。葛根素可使去卵巢大鼠Caspase-3蛋白表达降低， Bcl-2蛋白表达有所增加，并有一定的剂量-效应依赖关系。RT-PCR法检测到的二者mRNA表达量进一步证实了这一结果。由此推测，在雌激素缺乏或减少的状态下，葛根素通过下调Caspase-3含量，使细胞凋亡作用减弱；同时上调Bcl-2含量，在一定程度上恢复线粒体跨膜电位，并调制线粒体膜通透性转换孔的功能，因而阻止细胞凋亡的启动，从而对海马CA1区神经元起到保护作用。endprint

1.8 统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行分析。所有数据用—x±s表示，多组资料均数的比较采用方差分析，组间比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响

免疫组化检测结果显示，Bcl-2和Caspase-3蛋白阳性染色主要为细胞核着色（见图1、图2）。与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组Caspase-3蛋白表达均较模型组降低，其中葛根素高剂量组和阳性药组差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组Bcl-2蛋白表达均升高，其中阳性药组和葛根素高、中剂量组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

2.2 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2基因表达的影响

RT-PCR检测结果显示，与假手术组比较，模型组Caspase-3 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组Caspase-3 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，各组Bcl-2 mRNA表达均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，葛根素高剂量组Bcl-2 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

3 讨论

在神经系统相互作用中，雌激素除了作用于与生殖相关的神经回路外，还作用于与认知功能相关的神经回路——海马回路，从而影响学习和记忆[7]。前期研究表明，葛根素具有雌激素样作用，使海马CA1区神经元凋亡和损伤现象明显减轻[5]。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是目前研究得最清楚的细胞凋亡执行者。可分为启动型和效应型Caspase。Caspase-3属于效应型Caspase，是由28 kD的酶原经酶解作用生成由17 kD和12 kD两个亚单位组成的异二聚体，激活后可导致多种细胞凋亡，在蛋白酶级联切割中处于核心地位[8]。Bcl-2是高等动物中生存和死亡信号至关重要的整合因子之一，也是目前凋亡分子机制研究的主要靶分子，其编码产物Bcl-2蛋白可通过抑制钙离子释放和自由基生成，阻止促凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物，抑制细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，减轻脑组织的损伤[9]。

细胞凋亡信号的转导有死亡受体和线粒体介导的凋亡通路两种，在线粒体介导的凋亡通路中，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放引起的线粒体通透性增大，线粒体内物质向外释放，从而使线粒体跨膜电位明显降低，进而引起的能量代谢障碍是细胞凋亡机制之一。因此，阻止线粒体膜通透性的改变可减轻或防止细胞凋亡。本研究免疫组织化学研究结果表明，与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，表明去卵巢大鼠造模成功。葛根素可使去卵巢大鼠Caspase-3蛋白表达降低， Bcl-2蛋白表达有所增加，并有一定的剂量-效应依赖关系。RT-PCR法检测到的二者mRNA表达量进一步证实了这一结果。由此推测，在雌激素缺乏或减少的状态下，葛根素通过下调Caspase-3含量，使细胞凋亡作用减弱；同时上调Bcl-2含量，在一定程度上恢复线粒体跨膜电位，并调制线粒体膜通透性转换孔的功能，因而阻止细胞凋亡的启动，从而对海马CA1区神经元起到保护作用。endprint

1.8 统计学方法

采用SPSS15.0统计软件进行分析。所有数据用—x±s表示，多组资料均数的比较采用方差分析，组间比较采用q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响

免疫组化检测结果显示，Bcl-2和Caspase-3蛋白阳性染色主要为细胞核着色（见图1、图2）。与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组Caspase-3蛋白表达均较模型组降低，其中葛根素高剂量组和阳性药组差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，模型组Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组Bcl-2蛋白表达均升高，其中阳性药组和葛根素高、中剂量组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

2.2 葛根素对大鼠海马CA1区神经元Caspase-3和Bcl-2基因表达的影响

RT-PCR检测结果显示，与假手术组比较，模型组Caspase-3 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，阳性药组Caspase-3 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与假手术组比较，各组Bcl-2 mRNA表达均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，葛根素高剂量组Bcl-2 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

3 讨论

在神经系统相互作用中，雌激素除了作用于与生殖相关的神经回路外，还作用于与认知功能相关的神经回路——海马回路，从而影响学习和记忆[7]。前期研究表明，葛根素具有雌激素样作用，使海马CA1区神经元凋亡和损伤现象明显减轻[5]。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是目前研究得最清楚的细胞凋亡执行者。可分为启动型和效应型Caspase。Caspase-3属于效应型Caspase，是由28 kD的酶原经酶解作用生成由17 kD和12 kD两个亚单位组成的异二聚体，激活后可导致多种细胞凋亡，在蛋白酶级联切割中处于核心地位[8]。Bcl-2是高等动物中生存和死亡信号至关重要的整合因子之一，也是目前凋亡分子机制研究的主要靶分子，其编码产物Bcl-2蛋白可通过抑制钙离子释放和自由基生成，阻止促凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物，抑制细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，减轻脑组织的损伤[9]。

细胞凋亡信号的转导有死亡受体和线粒体介导的凋亡通路两种，在线粒体介导的凋亡通路中，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放引起的线粒体通透性增大，线粒体内物质向外释放，从而使线粒体跨膜电位明显降低，进而引起的能量代谢障碍是细胞凋亡机制之一。因此，阻止线粒体膜通透性的改变可减轻或防止细胞凋亡。本研究免疫组织化学研究结果表明，与假手术组比较，模型组Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，表明去卵巢大鼠造模成功。葛根素可使去卵巢大鼠Caspase-3蛋白表达降低， Bcl-2蛋白表达有所增加，并有一定的剂量-效应依赖关系。RT-PCR法检测到的二者mRNA表达量进一步证实了这一结果。由此推测，在雌激素缺乏或减少的状态下，葛根素通过下调Caspase-3含量，使细胞凋亡作用减弱；同时上调Bcl-2含量，在一定程度上恢复线粒体跨膜电位，并调制线粒体膜通透性转换孔的功能，因而阻止细胞凋亡的启动，从而对海马CA1区神经元起到保护作用。endprint