脾胃湿热证与幽门螺杆菌感染及热休克蛋白70表达的关系.pdf
喻斌+罗燕+王小娟+徐寅+郭璇+杜中华+夏蓉+尹姣
摘要：目的 观察灭幽汤对幽门螺杆菌（Hp）相关性胃炎脾胃湿热小鼠热休克蛋白70（HSP70）及水通道蛋白4（AQP4）的影响，探讨其作用机制。方法 将小鼠随机分为灭幽汤高、低剂量组（灭高组、灭低组）和胃三联组、模型组、对照组，采用复合因素建立BALB/c小鼠Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型，造模成功后连续给药14 d，灭高组、灭低组、胃三联组给药剂量分别为12.4、6.2 g/kg和0.279 8 mg/kg；采用Western Blot检测HSP70、免疫组化法检测AQP4的表达情况。结果 与对照组比较，模型组HSP70、AQP4蛋白表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠HSP70蛋白表达显著增加、AQP4蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 灭幽汤可能通过上调HSP70、下调AQP4蛋白表达而发挥治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用。
关键词：灭幽汤；幽门螺杆菌相关性胃炎；脾胃湿热证；热休克蛋白70；水通道蛋白4；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.12.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）12-0055-04
幽门螺杆菌（Hp）作为慢性胃炎的主要致病因素，长期感染可引起胃黏膜萎缩和肠上皮化生，引起胃癌、胃相关性淋巴瘤等恶性病变，因此，根除Hp是治疗慢性胃炎的关键环节之一。脾胃湿热证是脾胃病中的一个常见证型，临床研究表明，脾胃湿热证与Hp感染呈正相关性，湿热环境利于Hp生长繁殖，在脾胃湿热证中Hp感染率较高，而Hp在致病过程中常表现出“脾胃湿热”的症候[1-2]。近年来研究表明，热休克蛋白70（HSP70）、水通道蛋白4（AQP4）与脾胃湿热密切相关，在慢性胃炎的不同证型中，脾胃湿热组的HSP70、AQP4阳性表达率最高，在Hp感染的活动期，HSP70、AQP4的表达均处于高水平[3-5]。随着抗生素的耐药性增加，中医药为Hp相关性胃炎脾胃湿热证的治疗提供一条新途径。但目前尚未见将湿热环境与Hp作为复合因素造模研究，且缺少方药对该病的研究，灭幽汤是湖南中医药大学第一附属医院王小娟教授根据多年临床经验组方而成，在临床上取得了良好疗效[6]，并进行了作用机制研究[7-8]。本实验在前期研究基础上，从HSP70、AQP4表达进一步探索灭幽汤治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用机理。
1 实验材料
1.1 动物、菌种与饲料
SPF级BALB/c小鼠70只，雌雄各半，8周龄，购自南京君科生物科技有限公司，合格证号：SCXK（苏）2011- 0003）。Hp菌种：悉尼标准菌株（Sydney strain 1， SS1），SS1含有细胞毒素相关基因（cagA）蛋白和空泡细胞毒素（vacA），浓度为Hp菌液1×109 cfu/mL，湖南中医药大学基础医学院病原免疫学教研室提供。普通饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，高脂饲料（普通饲料+8%蜂蜜+12%猪油）由湖南斯莱克景达实验动物有限公司代加工。
1.2 药物
灭幽汤（黄芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陈皮、乌贼骨药材均购于湖南省药材公司饮片加工厂），药物浸泡30 min后，加水没过药面5 cm，武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20 min，取汁另置。继续加水，煎煮沸腾后，文火续煎20 min，取汁。两次药汁合并后浓缩至每毫升含原药材2 g，并用离心机去除药汁中残渣，4 ℃保存。枸橼酸铋钾，丽珠医药集团，批号1212248；替硝唑，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，批号121004；克拉霉素，杭州中美华东制药有限公司生产，批号121101。
1.3 主要试剂与仪器
胶体金法Hp检测试剂盒，艾康生物技术（杭州）有限公司，批号20123139；免疫组化HSP70一抗、二抗均购自Proteintech公司（一抗编号：SA00001-1，二抗编号：SA00001-2）；AQP4一抗购自武汉博士德生物工程有限公司（编号：BA1560），二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司（编号：SP9002）。台式冷冻离心机购自eppendorf公司，JY3002型电子天平购自上海精密科学仪器有限公司，LEICADM LB2型双目显微镜购自德国LEICA公司，Haier医用微波炉为青岛海尔集团生产，MIAS医学图像分析系统北航公司生产，Shandon325型石蜡切片机购自英国Shandon公司，DNP-9162型电热恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，Motic B5 显微摄像系统购自麦克奥迪实业集团公司。
2 实验方法
2.1 分组与造模
将70只BALB/c小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、灭幽汤高剂量组（灭高组）、灭幽汤低剂量组（灭低组）、胃三联组（替硝唑+克拉霉素+枸橼酸铋钾颗粒），每组14只，雌雄各半。对照组予普通饲料饲养，模型组、灭低组、灭高组、胃三联组予高脂饲料饲养，10 d后放入人工湿热箱内（温度32 ℃±2 ℃，湿度95%±1%），继续高脂饲料喂养，于第16日以浓度为1×109 cfu/mL Hp混悬液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h给食水。隔日感染1次，连续3次，感染后定植2周。2周后各组随机抽取2只小鼠做病理切片观察炎症情况，模型组、灭低组、灭高组、胃三联组各另取2只小鼠以胶体金法检测血浆Hp抗体，电镜下观察Hp定植情况。
2.2 给药及样本处理
灭低组、灭高组、胃三联组在造模成功后开始给药，按照小鼠与人体表面积比值换算公式，计算小鼠用药剂量，胃三联组小鼠用药剂量为279.8 mg/kg，灭高组给药剂量为12.4 g/kg，灭低组为6.2 g/kg，每日灌胃1次，其他组分别灌等量蒸馏水。给药后2周处死所有小鼠，将BALB/c小鼠仰卧位固定于鼠板，迅速取出胃标本，沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗干净，分别放入盛有10%甲醛溶液、4%多聚甲醛、无菌DEPC水的容器中，待做病理检测、免疫组化及Western Blot。endprint
2.3 观察指标及方法
2.3.1 胃组织病理观察 常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，常规脱蜡水洗；置苏木素染液中浸染2～4 min，水洗；1%盐酸分化约10 s，水洗；于流水中5～10 min，细胞核由淡紫红色变为蓝色时即可；置于伊红染液中浸染30 s；分别置于95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水；再用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明；中性树胶封片；光镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测水通道蛋白4 石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波炉加热修复抗原。3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加AQP4的一抗（1∶100），37 ℃孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。滴加AQP4二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积），以此表示AQP4蛋白的表达，进行半定量分析。
2.3.3 Western Blot检测热休克蛋白70 按照BCA蛋白定量试剂盒进行HSP70的免疫组化检测。配制适量BCA工作液，完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/mL，加用于稀释标准品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。测定波长，计算蛋白浓度。配10%～12%分离胶，加入TEMED，立即摇匀后灌胶并用异丙醇封胶。3 min后倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。进行电泳并转膜，转膜完毕后，TBST冲洗1次×5 min。检测蛋白转膜的效率，用TBST洗净后，用TBST配制5%脱脂奶粉封闭1 h再与HSP70一抗结合，洗膜后与二抗结合60 min，漂洗。ECL法检测NC膜，进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，因数据符合正态性和方差齐性，进行各组间方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模情况
模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证候。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，模型组符合慢性非萎缩性胃炎表现。可见，湿热环境、肥甘饮食及Hp定植综合病因制造的脾胃湿热证动物模型典型，在症状表现、病理检查及验方反证上均贴近临床，造模方法可行。
4.2 胃组织病理形态学观察
光镜下，对照组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，胃黏膜上皮排列紊乱，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层。灭低组炎症程度明显减轻，黏膜层少量炎性细胞浸润，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。灭高组和胃三联组胃黏膜上皮细胞排列整齐，炎症几乎全部消失。见图1。
4.3 各组小鼠胃黏膜水通道蛋白4免疫组化结果
黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，对照组小鼠胃黏膜组织AQP4有极少量表达；模型组小鼠胃黏膜组织AQP4有大量阳性表达；灭低组小鼠胃黏膜组织AQP4表达量明显少于模型组，多于灭高组及胃三联组；灭高组、胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量AQP4阳性表达，明显少于模型组。见图2。
4.4 灭幽汤对小鼠胃黏膜热休克蛋白70、水通道蛋白4表达的影响
与对照组比较，模型组HSP70、AQP4蛋白表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠HSP70蛋白表达显著增加（P<0.01），灭高组、灭低组、胃三联组小鼠AQP4蛋白表达显著降低（P<0.01）；胃三联组和灭高组HSP70、AQP4蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
5 讨论
有研究认为，Hp感染患者以“脾胃湿热证”为主，Hp可归属于中医六淫的“湿热之邪”，脾胃湿热证属“邪正交争”的实证，胃黏膜病理表现以充血、水肿、糜烂等炎性表现多见[9]。此外，在诸多证型中，脾胃湿热证更易导致体内环境改变，损伤胃黏膜屏障，给HP入侵创造条件，Hp与湿热之邪在病因学上属同一致病原，Hp感染有类似于湿热病邪隐匿性、渐进性、迁延性等特点。本研究从病因模拟建立Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型，本次造模研究从小鼠饮食、大小便及精神状态、光镜观察结果分析，本实验造模方法成功。
热休克蛋白是一类由热激发合成的蛋白，具有分子伴侣活性，能保护有机体自身。HSP70是该家族中表达最多，也是最重要的可诱导性应激蛋白。具有分子伴侣、抗炎、细胞保护及抗细胞凋亡功能，参与免疫调节。水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的高度保守的疏水性跨膜小分子整合蛋白。AQP4是AQPs家族成员之一，在全身许多器官组织中均有表达。主要具有渗透量调节、运输生物前体、代谢废物等生理功能。有研究表明，HSP70、AQP4与慢性浅表性胃炎脾胃湿热证密切相关，脾胃湿热证的极期，HSP70、AQP4有大量阳性表达；在慢性浅表性胃炎的各证型中，脾胃湿热证的阳性表达量最高[10]。
灭幽汤以清热利湿、理气和胃立法，是治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的专方。方中黄芩、蒲公英清热燥湿解毒为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌，修复局部之病灶；用乌贼骨制酸止痛而为之使。本研究表明，在湿热环境、肥甘饮食、Hp等多重因素的刺激下，HSP70蛋白表达量增加，而通过灭幽汤干预后，HSP70表达继续上升，HSP70表达的增加可能与其具有细胞保护、免疫调节功能等生理功能密切相关，它保护了胃黏膜细胞免受外界刺激损伤，促进受损细胞修复，从而增强了胃黏膜对应激损伤的抵抗能力，减少了胃黏膜细胞浸润，进而减轻了黏膜炎性反应。而AQP4的表达在复合因素刺激下升高，灭幽汤干预治疗后下降，可能与其代谢水液的功能有关。湿热困脾，脾主水液功能失常，引起水液代谢障碍，故与水液代谢密切相关的AQP4升高，而清热利湿的灭幽汤干预后，AQP4水平下降。最后我们推测灭幽汤通过上调HSP70、降低AQP4蛋白表达来达到治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的目的。
参考文献：
[1] 万莹.慢性胃炎脾胃湿热证流行病学、证候学及诊断标准相关因素的研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.
[2] Heyl KA， Fischer A， Gobel UB， et al. Inhibition of Helicobacter pylori urease activity in vivo by the synthetic nickel binding protein Hpn[J]. Eur J Microbiol Immunoi，2013，3（1）：77-80.
[3] 胡玲，郑晓凤，鄢学辉，等.不同证型慢性胃炎患者外周血淋巴细胞HSP70、NF-κB的表达研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（9）：1188- 1191.
[4] 李合国，李素娟，高军丽.慢性浅表性胃炎脾胃湿热证与水通道蛋白及线粒体相关性研究[J].新中医，2012，44（5）：33-35.
[5] 吴晋兰，徐珊，陈长春，等.慢性胃炎患者不同中医证型水通道蛋白表达的变化[J].中华中医药杂志，2011，26（3）：579-581.
[6] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对脾胃湿热型幽门螺杆菌感染慢性胃炎的临床观察[J].首都医药，2007，14（18）：36-37.
[7] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对慢性胃炎幽门螺杆菌定植的影响[J].中国中医药信息杂志，2008，15（1）：63-64.
[8] 郭璇，伍参荣，王小娟，等.灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎小鼠胃黏膜组织NF-κB和IκBα表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2010， 17（11）：27-28.
[9] 谢春娥，薛晓轩，刘晶，等.胃痛辨证分型及舌象与幽门螺杆菌感染的关系分析[J].中华中医药杂志，2013，8（28）：2287-2289.
[10] 廖圣银，曾俊，王爱瑶，等.慢性胃炎脾胃湿热证大鼠胃黏膜蛋白质组与三仁汤治疗的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2013，33（1）：76- 80.
（收稿日期：2014-03-08；编辑：华强）endprint
2.3 观察指标及方法
2.3.1 胃组织病理观察 常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，常规脱蜡水洗；置苏木素染液中浸染2～4 min，水洗；1%盐酸分化约10 s，水洗；于流水中5～10 min，细胞核由淡紫红色变为蓝色时即可；置于伊红染液中浸染30 s；分别置于95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水；再用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明；中性树胶封片；光镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测水通道蛋白4 石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波炉加热修复抗原。3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加AQP4的一抗（1∶100），37 ℃孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。滴加AQP4二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积），以此表示AQP4蛋白的表达，进行半定量分析。
2.3.3 Western Blot检测热休克蛋白70 按照BCA蛋白定量试剂盒进行HSP70的免疫组化检测。配制适量BCA工作液，完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/mL，加用于稀释标准品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。测定波长，计算蛋白浓度。配10%～12%分离胶，加入TEMED，立即摇匀后灌胶并用异丙醇封胶。3 min后倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。进行电泳并转膜，转膜完毕后，TBST冲洗1次×5 min。检测蛋白转膜的效率，用TBST洗净后，用TBST配制5%脱脂奶粉封闭1 h再与HSP70一抗结合，洗膜后与二抗结合60 min，漂洗。ECL法检测NC膜，进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，因数据符合正态性和方差齐性，进行各组间方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模情况
模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证候。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，模型组符合慢性非萎缩性胃炎表现。可见，湿热环境、肥甘饮食及Hp定植综合病因制造的脾胃湿热证动物模型典型，在症状表现、病理检查及验方反证上均贴近临床，造模方法可行。
4.2 胃组织病理形态学观察
光镜下，对照组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，胃黏膜上皮排列紊乱，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层。灭低组炎症程度明显减轻，黏膜层少量炎性细胞浸润，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。灭高组和胃三联组胃黏膜上皮细胞排列整齐，炎症几乎全部消失。见图1。
4.3 各组小鼠胃黏膜水通道蛋白4免疫组化结果
黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，对照组小鼠胃黏膜组织AQP4有极少量表达；模型组小鼠胃黏膜组织AQP4有大量阳性表达；灭低组小鼠胃黏膜组织AQP4表达量明显少于模型组，多于灭高组及胃三联组；灭高组、胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量AQP4阳性表达，明显少于模型组。见图2。
4.4 灭幽汤对小鼠胃黏膜热休克蛋白70、水通道蛋白4表达的影响
与对照组比较，模型组HSP70、AQP4蛋白表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠HSP70蛋白表达显著增加（P<0.01），灭高组、灭低组、胃三联组小鼠AQP4蛋白表达显著降低（P<0.01）；胃三联组和灭高组HSP70、AQP4蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
5 讨论
有研究认为，Hp感染患者以“脾胃湿热证”为主，Hp可归属于中医六淫的“湿热之邪”，脾胃湿热证属“邪正交争”的实证，胃黏膜病理表现以充血、水肿、糜烂等炎性表现多见[9]。此外，在诸多证型中，脾胃湿热证更易导致体内环境改变，损伤胃黏膜屏障，给HP入侵创造条件，Hp与湿热之邪在病因学上属同一致病原，Hp感染有类似于湿热病邪隐匿性、渐进性、迁延性等特点。本研究从病因模拟建立Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型，本次造模研究从小鼠饮食、大小便及精神状态、光镜观察结果分析，本实验造模方法成功。
热休克蛋白是一类由热激发合成的蛋白，具有分子伴侣活性，能保护有机体自身。HSP70是该家族中表达最多，也是最重要的可诱导性应激蛋白。具有分子伴侣、抗炎、细胞保护及抗细胞凋亡功能，参与免疫调节。水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的高度保守的疏水性跨膜小分子整合蛋白。AQP4是AQPs家族成员之一，在全身许多器官组织中均有表达。主要具有渗透量调节、运输生物前体、代谢废物等生理功能。有研究表明，HSP70、AQP4与慢性浅表性胃炎脾胃湿热证密切相关，脾胃湿热证的极期，HSP70、AQP4有大量阳性表达；在慢性浅表性胃炎的各证型中，脾胃湿热证的阳性表达量最高[10]。
灭幽汤以清热利湿、理气和胃立法，是治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的专方。方中黄芩、蒲公英清热燥湿解毒为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌，修复局部之病灶；用乌贼骨制酸止痛而为之使。本研究表明，在湿热环境、肥甘饮食、Hp等多重因素的刺激下，HSP70蛋白表达量增加，而通过灭幽汤干预后，HSP70表达继续上升，HSP70表达的增加可能与其具有细胞保护、免疫调节功能等生理功能密切相关，它保护了胃黏膜细胞免受外界刺激损伤，促进受损细胞修复，从而增强了胃黏膜对应激损伤的抵抗能力，减少了胃黏膜细胞浸润，进而减轻了黏膜炎性反应。而AQP4的表达在复合因素刺激下升高，灭幽汤干预治疗后下降，可能与其代谢水液的功能有关。湿热困脾，脾主水液功能失常，引起水液代谢障碍，故与水液代谢密切相关的AQP4升高，而清热利湿的灭幽汤干预后，AQP4水平下降。最后我们推测灭幽汤通过上调HSP70、降低AQP4蛋白表达来达到治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的目的。
参考文献：
[1] 万莹.慢性胃炎脾胃湿热证流行病学、证候学及诊断标准相关因素的研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.
[2] Heyl KA， Fischer A， Gobel UB， et al. Inhibition of Helicobacter pylori urease activity in vivo by the synthetic nickel binding protein Hpn[J]. Eur J Microbiol Immunoi，2013，3（1）：77-80.
[3] 胡玲，郑晓凤，鄢学辉，等.不同证型慢性胃炎患者外周血淋巴细胞HSP70、NF-κB的表达研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（9）：1188- 1191.
[4] 李合国，李素娟，高军丽.慢性浅表性胃炎脾胃湿热证与水通道蛋白及线粒体相关性研究[J].新中医，2012，44（5）：33-35.
[5] 吴晋兰，徐珊，陈长春，等.慢性胃炎患者不同中医证型水通道蛋白表达的变化[J].中华中医药杂志，2011，26（3）：579-581.
[6] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对脾胃湿热型幽门螺杆菌感染慢性胃炎的临床观察[J].首都医药，2007，14（18）：36-37.
[7] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对慢性胃炎幽门螺杆菌定植的影响[J].中国中医药信息杂志，2008，15（1）：63-64.
[8] 郭璇，伍参荣，王小娟，等.灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎小鼠胃黏膜组织NF-κB和IκBα表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2010， 17（11）：27-28.
[9] 谢春娥，薛晓轩，刘晶，等.胃痛辨证分型及舌象与幽门螺杆菌感染的关系分析[J].中华中医药杂志，2013，8（28）：2287-2289.
[10] 廖圣银，曾俊，王爱瑶，等.慢性胃炎脾胃湿热证大鼠胃黏膜蛋白质组与三仁汤治疗的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2013，33（1）：76- 80.
（收稿日期：2014-03-08；编辑：华强）endprint
2.3 观察指标及方法
2.3.1 胃组织病理观察 常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，常规脱蜡水洗；置苏木素染液中浸染2～4 min，水洗；1%盐酸分化约10 s，水洗；于流水中5～10 min，细胞核由淡紫红色变为蓝色时即可；置于伊红染液中浸染30 s；分别置于95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水；再用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明；中性树胶封片；光镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测水通道蛋白4 石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波炉加热修复抗原。3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加AQP4的一抗（1∶100），37 ℃孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。滴加AQP4二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积），以此表示AQP4蛋白的表达，进行半定量分析。
2.3.3 Western Blot检测热休克蛋白70 按照BCA蛋白定量试剂盒进行HSP70的免疫组化检测。配制适量BCA工作液，完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/mL，加用于稀释标准品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。测定波长，计算蛋白浓度。配10%～12%分离胶，加入TEMED，立即摇匀后灌胶并用异丙醇封胶。3 min后倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。进行电泳并转膜，转膜完毕后，TBST冲洗1次×5 min。检测蛋白转膜的效率，用TBST洗净后，用TBST配制5%脱脂奶粉封闭1 h再与HSP70一抗结合，洗膜后与二抗结合60 min，漂洗。ECL法检测NC膜，进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，因数据符合正态性和方差齐性，进行各组间方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模情况
模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证候。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，模型组符合慢性非萎缩性胃炎表现。可见，湿热环境、肥甘饮食及Hp定植综合病因制造的脾胃湿热证动物模型典型，在症状表现、病理检查及验方反证上均贴近临床，造模方法可行。
4.2 胃组织病理形态学观察
光镜下，对照组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，胃黏膜上皮排列紊乱，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层。灭低组炎症程度明显减轻，黏膜层少量炎性细胞浸润，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。灭高组和胃三联组胃黏膜上皮细胞排列整齐，炎症几乎全部消失。见图1。
4.3 各组小鼠胃黏膜水通道蛋白4免疫组化结果
黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，对照组小鼠胃黏膜组织AQP4有极少量表达；模型组小鼠胃黏膜组织AQP4有大量阳性表达；灭低组小鼠胃黏膜组织AQP4表达量明显少于模型组，多于灭高组及胃三联组；灭高组、胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量AQP4阳性表达，明显少于模型组。见图2。
4.4 灭幽汤对小鼠胃黏膜热休克蛋白70、水通道蛋白4表达的影响
与对照组比较，模型组HSP70、AQP4蛋白表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，灭高组、灭低组、胃三联组小鼠HSP70蛋白表达显著增加（P<0.01），灭高组、灭低组、胃三联组小鼠AQP4蛋白表达显著降低（P<0.01）；胃三联组和灭高组HSP70、AQP4蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
5 讨论
有研究认为，Hp感染患者以“脾胃湿热证”为主，Hp可归属于中医六淫的“湿热之邪”，脾胃湿热证属“邪正交争”的实证，胃黏膜病理表现以充血、水肿、糜烂等炎性表现多见[9]。此外，在诸多证型中，脾胃湿热证更易导致体内环境改变，损伤胃黏膜屏障，给HP入侵创造条件，Hp与湿热之邪在病因学上属同一致病原，Hp感染有类似于湿热病邪隐匿性、渐进性、迁延性等特点。本研究从病因模拟建立Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型，本次造模研究从小鼠饮食、大小便及精神状态、光镜观察结果分析，本实验造模方法成功。
热休克蛋白是一类由热激发合成的蛋白，具有分子伴侣活性，能保护有机体自身。HSP70是该家族中表达最多，也是最重要的可诱导性应激蛋白。具有分子伴侣、抗炎、细胞保护及抗细胞凋亡功能，参与免疫调节。水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的高度保守的疏水性跨膜小分子整合蛋白。AQP4是AQPs家族成员之一，在全身许多器官组织中均有表达。主要具有渗透量调节、运输生物前体、代谢废物等生理功能。有研究表明，HSP70、AQP4与慢性浅表性胃炎脾胃湿热证密切相关，脾胃湿热证的极期，HSP70、AQP4有大量阳性表达；在慢性浅表性胃炎的各证型中，脾胃湿热证的阳性表达量最高[10]。
灭幽汤以清热利湿、理气和胃立法，是治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的专方。方中黄芩、蒲公英清热燥湿解毒为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌，修复局部之病灶；用乌贼骨制酸止痛而为之使。本研究表明，在湿热环境、肥甘饮食、Hp等多重因素的刺激下，HSP70蛋白表达量增加，而通过灭幽汤干预后，HSP70表达继续上升，HSP70表达的增加可能与其具有细胞保护、免疫调节功能等生理功能密切相关，它保护了胃黏膜细胞免受外界刺激损伤，促进受损细胞修复，从而增强了胃黏膜对应激损伤的抵抗能力，减少了胃黏膜细胞浸润，进而减轻了黏膜炎性反应。而AQP4的表达在复合因素刺激下升高，灭幽汤干预治疗后下降，可能与其代谢水液的功能有关。湿热困脾，脾主水液功能失常，引起水液代谢障碍，故与水液代谢密切相关的AQP4升高，而清热利湿的灭幽汤干预后，AQP4水平下降。最后我们推测灭幽汤通过上调HSP70、降低AQP4蛋白表达来达到治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的目的。
参考文献：
[1] 万莹.慢性胃炎脾胃湿热证流行病学、证候学及诊断标准相关因素的研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.
[2] Heyl KA， Fischer A， Gobel UB， et al. Inhibition of Helicobacter pylori urease activity in vivo by the synthetic nickel binding protein Hpn[J]. Eur J Microbiol Immunoi，2013，3（1）：77-80.
[3] 胡玲，郑晓凤，鄢学辉，等.不同证型慢性胃炎患者外周血淋巴细胞HSP70、NF-κB的表达研究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（9）：1188- 1191.
[4] 李合国，李素娟，高军丽.慢性浅表性胃炎脾胃湿热证与水通道蛋白及线粒体相关性研究[J].新中医，2012，44（5）：33-35.
[5] 吴晋兰，徐珊，陈长春，等.慢性胃炎患者不同中医证型水通道蛋白表达的变化[J].中华中医药杂志，2011，26（3）：579-581.
[6] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对脾胃湿热型幽门螺杆菌感染慢性胃炎的临床观察[J].首都医药，2007，14（18）：36-37.
[7] 王小娟，郭建生，李倩，等.灭幽汤对慢性胃炎幽门螺杆菌定植的影响[J].中国中医药信息杂志，2008，15（1）：63-64.
[8] 郭璇，伍参荣，王小娟，等.灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎小鼠胃黏膜组织NF-κB和IκBα表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2010， 17（11）：27-28.
[9] 谢春娥，薛晓轩，刘晶，等.胃痛辨证分型及舌象与幽门螺杆菌感染的关系分析[J].中华中医药杂志，2013，8（28）：2287-2289.
[10] 廖圣银，曾俊，王爱瑶，等.慢性胃炎脾胃湿热证大鼠胃黏膜蛋白质组与三仁汤治疗的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2013，33（1）：76- 80.
（收稿日期：2014-03-08；编辑：华强）endprint
