...囊对高尿酸血症大鼠血尿酸及黄嘌呤氧化酶的影响.pdf
杨雪芳+高克立+王永昌+张永东+郭红云+苏海翔
摘要：目的 探讨加味四物四藤汤中两种不同工艺提取物（TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ）和复方中黄芪对高尿酸血症作用的强度差异。方法 采用次黄嘌呤合并氧嗪酸钾盐诱导造成高尿酸血症模型。70只大鼠随机分为空白组、模型组、别嘌呤醇组、TFT-Ⅰ低剂量组、TFT-Ⅰ高剂量组、TFT-Ⅱ低剂量组、TFT-Ⅱ高剂量组，各给药组予相应药物灌胃，空白组和模型组予等量蒸馏水灌胃，每日1次，连续给药7 d。采用全自动生化分析仪测定大鼠血清尿酸（SUA）水平，采用比色法测定大鼠血清、肝组织黄嘌呤氧化酶（XOD）活性。结果 与模型组比较，TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组可显著降低大鼠血清SUA水平及血清、肝组织XOD活性（P<0.05），且2组比较差异有统计学意义（P<0.05）；TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ低剂量对上述炎性因子影响差异无统计学意义（P>0.05）。结论 加味四物四藤汤中黄芪和四物汤的醇溶性成分能有效降低SUA水平。
关键词：加味四物四藤汤；高尿酸血症；黄嘌呤氧化酶；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）11-0066-03
痛风是由于嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少导致血尿酸（SUA）水平升高的一种晶体性关节炎，高尿酸血症是痛风的重要生化基础，其与肥胖症、高脂血症、高血压、糖尿病等疾病的发生密切相关。加味四物四藤汤是临床应用多年的治疗痛风的经验方，本研究采用次黄嘌呤合并氧嗪酸钾盐诱导造成高尿酸血症模型，观察其不同提取物对高尿酸血症大鼠SUA及黄嘌呤氧化酶（XOD）的影响，探讨复方中黄芪和四物汤水提与醇提加水提两种不同提取工艺所获产物对高尿酸血症作用的强度差异，筛选疗效更好的提取工艺及其制剂。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购自甘肃中医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK（甘） 2011-0001。
1.2 药物与制备
加味四物四藤汤由黄芪、青风藤、络石藤、忍冬藤、海风藤、熟地黄、当归、赤芍、川芎、牛膝等中药组成，所有药材均购自兰州安泰堂中药饮片有限公司，经甘肃省肿瘤医院中药房专家鉴定。取加味四物四藤汤组方中的黄芪和四物汤部分用80%醇提得醇溶性成分，收集提取液经低温减压浓缩回收得干浸膏a；黄芪和四物汤80%醇提后的药渣用水煎煮得水溶性成分，收集提取液水浴蒸干得浸膏b；组方中其他剩余药材用80%醇提（得醇溶性成分），收集提取液经低温减压浓缩回收得干浸膏c；a、b、c三部分干浸膏混匀，恒温干燥后得浸膏粉，命名为TFT-Ⅰ，每克浸膏粉相当于4.10 g原药材。取加味四物四藤汤组方中黄芪和四物汤部分用水煎煮，收集提取液水浴蒸干得浸膏d，组方中其他药材用80%醇提，收集提取液经低温减压浓缩回收得干浸膏e；d、e两部分干浸膏混匀，恒温干燥后得浸膏粉，命名为TFT-Ⅱ，每克浸膏粉相当于4.54 g原药材。次黄嘌呤，上海Solarbio公司产品，批号H8010；别嘌呤醇，上海信谊万象药业股份有限公司，批号05120902；氧嗪酸钾，上海源叶生物科技有限公司，批号14824。
1.3 主要试剂与仪器
黄嘌呤氧化酶测定试剂盒（批号20130710）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20130624）均为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。FSH-Ⅱ高速电动匀浆机（江苏金坛市环宇科学仪器厂），全自动生化仪（HITACHI有限公司），TDLSM台式大容量冷冻离心机（长沙湘仪仪器有限公司），721分光光度（上海第三分析仪器厂），恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
于末次给药前1 h，用碘酒消毒局部，腹腔注射次黄嘌呤250 mg/kg，同时皮下注射氧嗪酸钾100 mg/kg造成高尿酸血症大鼠模型。实验大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、TFT-Ⅰ低剂量组（1.24 g/kg）、TFT-Ⅰ高剂量组（2.48 g/kg）、TFT-Ⅱ低剂量组 （1.48 g/kg）、TFT-Ⅱ高剂量组（2.96 g/kg）和别嘌呤醇组（0.045 g/kg），每组10只。空白组、模型组给予等容积蒸馏水灌胃；别嘌呤醇组给予别嘌呤醇溶液0.045 g/mL灌胃；TFT-Ⅰ高、低剂量组给予TFT-Ⅰ 2.48、1.24 g/kg灌胃；TFT-Ⅱ高、低剂量组给予TFT-Ⅱ 2.96、1.48 g/kg灌胃，给药容积为10 mL/kg，每日1次，连续7 d。
2.2 指标检测
于末次给药后1 h，大鼠股动脉采血，3000 r/min离心10 min，置于-80 ℃保存。处死动物后，于置有冰块的干燥托盘内快速取肝组织，称取400～500 mg肝组织，按1∶9加生理盐水稀释，以12 000 r/min匀浆，将制备好的10%匀浆低温离心，吸取上清液，备检。采用全自动生化分析仪测定大鼠SUA水平；采用比色法按照试剂盒说明书测定大鼠血清、肝组织黄嘌呤XOD活性[1]。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。所有计量资料用—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 加味四物四藤汤不同提取物对大鼠血清尿酸水平的影响
与空白组比较，模型组SUA水平显著升高（P<0.05），说明造模成功；与模型组比较，TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组均显著降低血SUA水平（P<0.05），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
4.2 加味四物四藤汤不同提取物对大鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响
与空白组比较，模型组血清、肝组织XOD活性均升高（P<0.05）；与模型组比较，TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组显著抑制血清、肝组织XOD活性（P<0.05），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
5 讨论
嘌呤化合物在人类等动物体内分解代谢为尿酸，经尿酸XOD可分解为易溶于水的产物，而人类缺乏尿酸XOD，易发生高尿酸血症，但实验室常用的啮齿类动物体内存在尿酸XOD，故本实验选用尿酸XOD抑制剂氧嗪酸钾盐，并增加尿酸生成前体次黄嘌呤建立高尿酸血症模型。该法灵敏简便、重复性好，已普遍用于抗高尿酸血症药物的筛选。
XOD是嘌呤代谢的关键酶，直接影响尿酸生成，在高尿酸血症的发病中占重要地位。临床上将人血浆中的尿酸>420 μmol/L诊断为高尿酸血症，当血浆中尿酸盐浓度超过480 mmol/L时，即可析出结晶，沉积于关节、软组织及肾脏组织引起一系列炎症反应，从而形成痛风，因此，降低SUA是预防痛风发作的根本。
目前西医治疗高尿酸血症的药物对胃肠道、肝肾功能等损害严重，不利于临床长期用药。中医认为，高尿酸血症属“痹证”范畴，是由于平素过食膏粱厚味，湿热内泛，兼外感风邪，气血不能畅通、热邪痰阻经脉而致。加味四物四藤汤组方中四物汤为补血活血的经典名方，具有养血滋阴、益肾行气，补而不滞、行血而不耗血等功效。目前已知的黄芪和四物汤醇溶及水溶性主要有效成分具有一定的补血养血及调节机体免疫功能的作用[2]，对高尿酸血症中的瘀血阻滞具有化解作用，黄芪加四物汤使气血充足，黄芪、牛膝、车前子具有降低血尿酸作用[3-5]。为更好地发挥其在高尿酸血症治疗中的效果，本研究采用2种不同提取工艺进行提取，先将加味四物四藤汤为拆解为“黄芪四物汤”和“四藤汤+牛膝、车前子、透骨草”两部分。提取工艺Ⅰ分别用80%乙醇提取黄芪四物汤中的醇溶性成分，再提取其中的水溶性成分，最后与从四藤汤和其他成分中提取得到的醇溶性成分混合。与工艺Ⅰ相比，提取工艺Ⅱ得到的产物中缺乏来自黄芪四物汤中的醇溶性成分。实验结果显示，虽然TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组能显著降低高尿酸血症大鼠SUA水平及血清、肝组织XOD活性，但TFT-Ⅱ降低SUA水平及抑制血清XOD活性的作用不及TFT-Ⅰ，表明在加味四物四藤汤中黄芪和四物汤的醇溶性成分可更有效地降低SUA水平。本课题仅对加味四物四藤汤的2种提取工艺的研究进行了初探，有关该复方降尿酸作用的有效部位还需深入研究，需进一步拆分复方中的各个组分，对多种提取工艺进行比较研究，并对提取物进行成分分析，根据有效成分的含量、生产成本等，进一步筛选出合理、有效的提取工艺。
参考文献：
[1] 吕耀中，胡庆华，王星，等.二妙丸水提取物对高尿酸血症小鼠尿酸失衡及其相关基因和蛋白水平的影响[J].中草药，2010，41（3）：418-423.
[2] 贾魁荣.古方四物汤的复方活性物质[J].中国临床医生，2008，36（8）：21-22.
[3] 杨传经，李雪梅，孔德明，等.单味中药黄芪改善胰岛素抵抗对血尿酸影响的相关性研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1621-1623.
[4] 杨研华，尹莲，朱晓勤，等.牛膝总皂苷的制备及其保护尿酸钠致血管内皮细胞损伤的作用[J].中医药信息，2010，27（2）：15-18.
[5] 钱莺，傅旭春，白海波，等.车前草醇提液降大鼠血尿酸作用的研究[J].中国现代应用药学，2011，28（5）：406-408.
（收稿日期：2013-12-28；编辑：华强）
4.2 加味四物四藤汤不同提取物对大鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响
与空白组比较，模型组血清、肝组织XOD活性均升高（P<0.05）；与模型组比较，TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组显著抑制血清、肝组织XOD活性（P<0.05），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
5 讨论
嘌呤化合物在人类等动物体内分解代谢为尿酸，经尿酸XOD可分解为易溶于水的产物，而人类缺乏尿酸XOD，易发生高尿酸血症，但实验室常用的啮齿类动物体内存在尿酸XOD，故本实验选用尿酸XOD抑制剂氧嗪酸钾盐，并增加尿酸生成前体次黄嘌呤建立高尿酸血症模型。该法灵敏简便、重复性好，已普遍用于抗高尿酸血症药物的筛选。
XOD是嘌呤代谢的关键酶，直接影响尿酸生成，在高尿酸血症的发病中占重要地位。临床上将人血浆中的尿酸>420 μmol/L诊断为高尿酸血症，当血浆中尿酸盐浓度超过480 mmol/L时，即可析出结晶，沉积于关节、软组织及肾脏组织引起一系列炎症反应，从而形成痛风，因此，降低SUA是预防痛风发作的根本。
目前西医治疗高尿酸血症的药物对胃肠道、肝肾功能等损害严重，不利于临床长期用药。中医认为，高尿酸血症属“痹证”范畴，是由于平素过食膏粱厚味，湿热内泛，兼外感风邪，气血不能畅通、热邪痰阻经脉而致。加味四物四藤汤组方中四物汤为补血活血的经典名方，具有养血滋阴、益肾行气，补而不滞、行血而不耗血等功效。目前已知的黄芪和四物汤醇溶及水溶性主要有效成分具有一定的补血养血及调节机体免疫功能的作用[2]，对高尿酸血症中的瘀血阻滞具有化解作用，黄芪加四物汤使气血充足，黄芪、牛膝、车前子具有降低血尿酸作用[3-5]。为更好地发挥其在高尿酸血症治疗中的效果，本研究采用2种不同提取工艺进行提取，先将加味四物四藤汤为拆解为“黄芪四物汤”和“四藤汤+牛膝、车前子、透骨草”两部分。提取工艺Ⅰ分别用80%乙醇提取黄芪四物汤中的醇溶性成分，再提取其中的水溶性成分，最后与从四藤汤和其他成分中提取得到的醇溶性成分混合。与工艺Ⅰ相比，提取工艺Ⅱ得到的产物中缺乏来自黄芪四物汤中的醇溶性成分。实验结果显示，虽然TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组能显著降低高尿酸血症大鼠SUA水平及血清、肝组织XOD活性，但TFT-Ⅱ降低SUA水平及抑制血清XOD活性的作用不及TFT-Ⅰ，表明在加味四物四藤汤中黄芪和四物汤的醇溶性成分可更有效地降低SUA水平。本课题仅对加味四物四藤汤的2种提取工艺的研究进行了初探，有关该复方降尿酸作用的有效部位还需深入研究，需进一步拆分复方中的各个组分，对多种提取工艺进行比较研究，并对提取物进行成分分析，根据有效成分的含量、生产成本等，进一步筛选出合理、有效的提取工艺。
参考文献：
[1] 吕耀中，胡庆华，王星，等.二妙丸水提取物对高尿酸血症小鼠尿酸失衡及其相关基因和蛋白水平的影响[J].中草药，2010，41（3）：418-423.
[2] 贾魁荣.古方四物汤的复方活性物质[J].中国临床医生，2008，36（8）：21-22.
[3] 杨传经，李雪梅，孔德明，等.单味中药黄芪改善胰岛素抵抗对血尿酸影响的相关性研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1621-1623.
[4] 杨研华，尹莲，朱晓勤，等.牛膝总皂苷的制备及其保护尿酸钠致血管内皮细胞损伤的作用[J].中医药信息，2010，27（2）：15-18.
[5] 钱莺，傅旭春，白海波，等.车前草醇提液降大鼠血尿酸作用的研究[J].中国现代应用药学，2011，28（5）：406-408.
（收稿日期：2013-12-28；编辑：华强）
4.2 加味四物四藤汤不同提取物对大鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响
与空白组比较，模型组血清、肝组织XOD活性均升高（P<0.05）；与模型组比较，TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组显著抑制血清、肝组织XOD活性（P<0.05），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
5 讨论
嘌呤化合物在人类等动物体内分解代谢为尿酸，经尿酸XOD可分解为易溶于水的产物，而人类缺乏尿酸XOD，易发生高尿酸血症，但实验室常用的啮齿类动物体内存在尿酸XOD，故本实验选用尿酸XOD抑制剂氧嗪酸钾盐，并增加尿酸生成前体次黄嘌呤建立高尿酸血症模型。该法灵敏简便、重复性好，已普遍用于抗高尿酸血症药物的筛选。
XOD是嘌呤代谢的关键酶，直接影响尿酸生成，在高尿酸血症的发病中占重要地位。临床上将人血浆中的尿酸>420 μmol/L诊断为高尿酸血症，当血浆中尿酸盐浓度超过480 mmol/L时，即可析出结晶，沉积于关节、软组织及肾脏组织引起一系列炎症反应，从而形成痛风，因此，降低SUA是预防痛风发作的根本。
目前西医治疗高尿酸血症的药物对胃肠道、肝肾功能等损害严重，不利于临床长期用药。中医认为，高尿酸血症属“痹证”范畴，是由于平素过食膏粱厚味，湿热内泛，兼外感风邪，气血不能畅通、热邪痰阻经脉而致。加味四物四藤汤组方中四物汤为补血活血的经典名方，具有养血滋阴、益肾行气，补而不滞、行血而不耗血等功效。目前已知的黄芪和四物汤醇溶及水溶性主要有效成分具有一定的补血养血及调节机体免疫功能的作用[2]，对高尿酸血症中的瘀血阻滞具有化解作用，黄芪加四物汤使气血充足，黄芪、牛膝、车前子具有降低血尿酸作用[3-5]。为更好地发挥其在高尿酸血症治疗中的效果，本研究采用2种不同提取工艺进行提取，先将加味四物四藤汤为拆解为“黄芪四物汤”和“四藤汤+牛膝、车前子、透骨草”两部分。提取工艺Ⅰ分别用80%乙醇提取黄芪四物汤中的醇溶性成分，再提取其中的水溶性成分，最后与从四藤汤和其他成分中提取得到的醇溶性成分混合。与工艺Ⅰ相比，提取工艺Ⅱ得到的产物中缺乏来自黄芪四物汤中的醇溶性成分。实验结果显示，虽然TFT-Ⅰ、TFT-Ⅱ高剂量组能显著降低高尿酸血症大鼠SUA水平及血清、肝组织XOD活性，但TFT-Ⅱ降低SUA水平及抑制血清XOD活性的作用不及TFT-Ⅰ，表明在加味四物四藤汤中黄芪和四物汤的醇溶性成分可更有效地降低SUA水平。本课题仅对加味四物四藤汤的2种提取工艺的研究进行了初探，有关该复方降尿酸作用的有效部位还需深入研究，需进一步拆分复方中的各个组分，对多种提取工艺进行比较研究，并对提取物进行成分分析，根据有效成分的含量、生产成本等，进一步筛选出合理、有效的提取工艺。
参考文献：
[1] 吕耀中，胡庆华，王星，等.二妙丸水提取物对高尿酸血症小鼠尿酸失衡及其相关基因和蛋白水平的影响[J].中草药，2010，41（3）：418-423.
[2] 贾魁荣.古方四物汤的复方活性物质[J].中国临床医生，2008，36（8）：21-22.
[3] 杨传经，李雪梅，孔德明，等.单味中药黄芪改善胰岛素抵抗对血尿酸影响的相关性研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1621-1623.
[4] 杨研华，尹莲，朱晓勤，等.牛膝总皂苷的制备及其保护尿酸钠致血管内皮细胞损伤的作用[J].中医药信息，2010，27（2）：15-18.
[5] 钱莺，傅旭春，白海波，等.车前草醇提液降大鼠血尿酸作用的研究[J].中国现代应用药学，2011，28（5）：406-408.
（收稿日期：2013-12-28；编辑：华强）
