高效液相色谱法测定六味能消胶囊中蒽醌类成分的含量.doc
杨金草+曹炯
摘要：目的 建立测定藏药六味能消散中蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法。色谱柱为Eclipse XDB C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12），检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min。结果 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分别在0.076～0.380 ?g（r=0.999 6）、0.068～0.340 ?g（r=0.999 8）、0.076～0.380 ?g（r=0.999 9）、0.070～0.349 ?g（r=0.999 9）、0.071～0.355 ?g（r=0.999 7）范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系，平均加样回收率分别为97.88%（RSD=0.72%）、97.52%（RSD=0.96%）、98.79% （RSD=0.95%）、97.77%（RSD=1.18%）、96.34%（RSD=2.00%）。结论 本方法简便、准确、重复性好，可用于藏药六味能消散的质量控制。
关键词：高效液相色谱法；六味能消散；芦荟大黄素；大黄酸；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0072-03
六味能消散为常用藏药制剂，由大黄、藏木香、干姜、诃子、碱花、寒水石6味药组成，具有和胃健脾、消积导滞、活血止痛功效。该药收载于《卫生部药品标准·藏药》（第一册）[1]，但其项下只有散剂的常规检验，没有含量测定内容，不能准确、专属地控制藏药六味能消散质量。大黄为处方中臣药，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经之功效。蒽醌类衍生物为大黄中主要抗菌成分，含量较高，因此有必要增加专属性强的含量测定方法。为了进一步控制该药品质量，
通讯作者：曹炯，E-mail：563407225@qq.com
本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定该制剂大黄中蒽醌类衍生物含量。
1 仪器与试药
岛津SPD-20A高效液相色谱仪（日本岛津）及其配套工作站，包括紫外检测器、SPD-20A、LC-20A泵（四元梯度单元）、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、CBM-20A控制器、SUS20A混合器流路在线脱气机；BT224S型分析天平、CP-225D型分析天平 （赛多利斯科学仪器有限公司）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。WFH-201BJ CAMAG薄层成像系统（上海CAMAG中国技术支持中心）。
芦荟大黄素对照品（批号110795-201007，含量以98.0%计，以五氧化二磷为干燥剂干燥12 h后用）、大黄酸对照品（批号110757-200206）、大黄素对照品（批号110756-200110）、大黄酚对照品（批号110796- 201017）、大黄素甲醚对照品（批号110758-201013）均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限责任公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。六味能消散（甘南藏族自治州碌曲县西仓寺院藏医院自制）。
2 蒽醌类衍生物含量测定
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；以外标法定量。结果阴性对照对含量测定无干扰，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取芦荟大黄素对照品9.51 mg、大黄酸对照品8.50 mg、大黄素对照品9.55 mg、大黄酚对照品8.72 mg、大黄素甲醚对照品8.88 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别制成每1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚85 μg的溶液，作为对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液各2 mL，混匀，即得每1 mL含芦荟大黄素19.02 μg、大黄酸17.00 μg、大黄素19.10 μg、大黄酚17.44 μg、大黄素甲醚17.76 μg的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取本品内容物约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧杯中，水浴蒸干，加8%盐酸溶液10 mL，再加三氯甲烷15 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）2 min，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方制备工艺制成缺大黄的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.5 线性关系考察
精密吸取上述对照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，按上述色谱条件分别进样，测定。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得芦荟大黄素的回归方程为Y=4739.67X+3.28
（r=0.999 6）、大黄酸的回归方程为Y=3959.48X+2.32（r=0.999 8）、大黄素的回归方程为Y=3200.47X+6.94（r=0.999 9）、大黄酚的回归方程为Y=4992.46X+32.29（r=0.999 9）、大黄素甲醚的回归方程为Y=4730.59X-1.71（r=0.999 7）。结果表明，5种成分进样量分别在0.076～0.380、0.068～0.340、0.076～0.380、0.070～0.349、0.071～0.355 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.91%、0.83%、0.95%、1.02%、0.89%（n=6），表明仪器的精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（批号20121001）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按样品含量测定方法测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.52、0.34、0.43、0.26、0.29 mg/mL，RSD分别为0.89%、1.22%、0.73%、0.86%、1.40%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.51、0.35、0.43、0.26、0.28 mg/mL，RSD分别为0.96%、1.03%、0.78%、0.84%、1.31%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
2.10 样品含量测定
3 讨论
优化流动相时，参考文献[2-3]，采用乙腈、甲醇、磷酸系统的不同配比（80∶20、85∶15、88∶12）进行试验。结果随着乙腈、甲醇体积分数的增大，蒽醌类衍生物的保留时间相对减少；当以甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）为流动相时，能够获得较好的分离效果和较短的分离时间，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，所以选择此流动相系统作为本试验的流动相。
在选择检测波长时，从DAD检测器收集到的信息可知蒽醌类衍生物在（225±2）、（254±2）、（428±2）nm波长处均有最大吸收[3-4]，但从三维图谱结果来看， （254±2）nm波长处的响应值较其他两处大，故在上述色谱条件下确定254 nm为检测波长。
在提取时，将三氯甲烷和酸液同时加入，沸水浴回流水解提取同时进行，不但简化了试验步骤，而且提高了萃取效率。经三氯甲烷提取后可排除其他非测定物质的干扰。
本试验结果表明，5批六味能消散中的5个指标性成分含量差异较大，这可能与原料的质量和生产工艺有关。考虑到原料含量的差异、大生产过程中的损失以及试验操作过程中的误差，结合实际生产，转移率按80%计算，并综合考虑单味药大黄的含量限度，建议本品总蒽醌的含量限度为：本品每克含大黄以5种蒽醌类衍生物的总量计，不得少于2.2 mg。
参考文献：
[1] 卫生部药典委员会.卫生部药品标准：藏药[S].1995：292.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：22.
[3] 贺凡珍，蔡学莹，彭维，等.HPLC法同时测定酒大黄中5种蒽醌的含量[J].中成药，2011，34（9）：1384-1385.
[4] 吴俊珠，周浓，罗碧燕.HPLC测定黄连上清丸中5种大黄蒽醌类化合物的含量[J].云南中医中药杂志，2010，31（9）：66-67.
（收稿日期：2014-01-28；编辑：陈静）
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.91%、0.83%、0.95%、1.02%、0.89%（n=6），表明仪器的精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（批号20121001）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按样品含量测定方法测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.52、0.34、0.43、0.26、0.29 mg/mL，RSD分别为0.89%、1.22%、0.73%、0.86%、1.40%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.51、0.35、0.43、0.26、0.28 mg/mL，RSD分别为0.96%、1.03%、0.78%、0.84%、1.31%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
2.10 样品含量测定
3 讨论
优化流动相时，参考文献[2-3]，采用乙腈、甲醇、磷酸系统的不同配比（80∶20、85∶15、88∶12）进行试验。结果随着乙腈、甲醇体积分数的增大，蒽醌类衍生物的保留时间相对减少；当以甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）为流动相时，能够获得较好的分离效果和较短的分离时间，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，所以选择此流动相系统作为本试验的流动相。
在选择检测波长时，从DAD检测器收集到的信息可知蒽醌类衍生物在（225±2）、（254±2）、（428±2）nm波长处均有最大吸收[3-4]，但从三维图谱结果来看， （254±2）nm波长处的响应值较其他两处大，故在上述色谱条件下确定254 nm为检测波长。
在提取时，将三氯甲烷和酸液同时加入，沸水浴回流水解提取同时进行，不但简化了试验步骤，而且提高了萃取效率。经三氯甲烷提取后可排除其他非测定物质的干扰。
本试验结果表明，5批六味能消散中的5个指标性成分含量差异较大，这可能与原料的质量和生产工艺有关。考虑到原料含量的差异、大生产过程中的损失以及试验操作过程中的误差，结合实际生产，转移率按80%计算，并综合考虑单味药大黄的含量限度，建议本品总蒽醌的含量限度为：本品每克含大黄以5种蒽醌类衍生物的总量计，不得少于2.2 mg。
参考文献：
[1] 卫生部药典委员会.卫生部药品标准：藏药[S].1995：292.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：22.
[3] 贺凡珍，蔡学莹，彭维，等.HPLC法同时测定酒大黄中5种蒽醌的含量[J].中成药，2011，34（9）：1384-1385.
[4] 吴俊珠，周浓，罗碧燕.HPLC测定黄连上清丸中5种大黄蒽醌类化合物的含量[J].云南中医中药杂志，2010，31（9）：66-67.
（收稿日期：2014-01-28；编辑：陈静）
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.91%、0.83%、0.95%、1.02%、0.89%（n=6），表明仪器的精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（批号20121001）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按样品含量测定方法测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.52、0.34、0.43、0.26、0.29 mg/mL，RSD分别为0.89%、1.22%、0.73%、0.86%、1.40%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.51、0.35、0.43、0.26、0.28 mg/mL，RSD分别为0.96%、1.03%、0.78%、0.84%、1.31%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
2.10 样品含量测定
3 讨论
优化流动相时，参考文献[2-3]，采用乙腈、甲醇、磷酸系统的不同配比（80∶20、85∶15、88∶12）进行试验。结果随着乙腈、甲醇体积分数的增大，蒽醌类衍生物的保留时间相对减少；当以甲醇-0.1%磷酸溶液（88∶12）为流动相时，能够获得较好的分离效果和较短的分离时间，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，所以选择此流动相系统作为本试验的流动相。
在选择检测波长时，从DAD检测器收集到的信息可知蒽醌类衍生物在（225±2）、（254±2）、（428±2）nm波长处均有最大吸收[3-4]，但从三维图谱结果来看， （254±2）nm波长处的响应值较其他两处大，故在上述色谱条件下确定254 nm为检测波长。
在提取时，将三氯甲烷和酸液同时加入，沸水浴回流水解提取同时进行，不但简化了试验步骤，而且提高了萃取效率。经三氯甲烷提取后可排除其他非测定物质的干扰。
本试验结果表明，5批六味能消散中的5个指标性成分含量差异较大，这可能与原料的质量和生产工艺有关。考虑到原料含量的差异、大生产过程中的损失以及试验操作过程中的误差，结合实际生产，转移率按80%计算，并综合考虑单味药大黄的含量限度，建议本品总蒽醌的含量限度为：本品每克含大黄以5种蒽醌类衍生物的总量计，不得少于2.2 mg。
参考文献：
[1] 卫生部药典委员会.卫生部药品标准：藏药[S].1995：292.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：22.
[3] 贺凡珍，蔡学莹，彭维，等.HPLC法同时测定酒大黄中5种蒽醌的含量[J].中成药，2011，34（9）：1384-1385.
[4] 吴俊珠，周浓，罗碧燕.HPLC测定黄连上清丸中5种大黄蒽醌类化合物的含量[J].云南中医中药杂志，2010，31（9）：66-67.
（收稿日期：2014-01-28；编辑：陈静）
