外源性硫化氢对大鼠深Ⅱ 烧伤创面巨噬细胞数量和微血管数量的影响....
张紫豪 高素玥 崔文浩
[摘要]目的：觀察纳米银抗菌凝胶联合重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合、巨噬细胞数量以及微血管再生的影响。方法：选取健康SD大鼠114只（6只作为非烫伤正常对照组，不作任何处理），剩余SD大鼠按照随机数字法分为3组，rhGM-CSF组、联合组和模型组，每组36只。制作深Ⅱ度烫伤创面模型，rhGM-CSF组大鼠创面涂抹rhGM-CSF，联合组应用纳米银抗菌凝胶和rhGM-CSF涂抹，模型组不作任何处理。比较各组创面愈合率，创面巨噬细胞数量以及微血管密度数量。结果：同一时间点，rhGM-CSF组和联合组愈合率均高于模型组，且联合组愈合率显著大于rhGM-CSF组，差异有统计学意义（P<0.05）；联合组第3、11、14天创面浸润巨噬细胞数量均少于模型组和rhGM-CSF组（P<0.05）；第3、7、11天，联合组微血管数量显著高于模型组和rhGM-CSF组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：纳米银抗菌凝胶联合rhGM-CSF治疗深Ⅱ度烫伤效果确切，可以通过影响烫伤创面巨噬细胞数量和微血管生成促进烫伤创面愈合。
[关键词]纳米银抗菌凝胶；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；烫伤；巨噬细胞；微血管
[中图分类号]R644 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）03-0104-04
Effect of Nano Silver Antibacterial Gel on the Deep Ⅱ Degrees of Rat Scalded Wound Healing and the Number of Macrophages， the Microvascular Density
ZHANG Zi-hao 1，GAO Su-yue2，CUI Wen-hao3
（1.Chinese PLA General Hospital，Beijing 100000，China；2.the Second Hospital Affiliated to Suzhou University，Suzhou 215004，Jiangsu，China；3.the First People's Hospital of Jinzhong，Jinzhong 030600，Shanxi，China）
Abstract： Objective To observe the effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF on the deep Ⅱ degrees of rat scalded wound healing and the number of macrophages， the microvascular density. Methods A total of 114 healthy SD rats （6 rats served as non scald normal control group， without any treatment） were selected， the remaining SD rats were randomly divided into 3 groups， the rhGM-CSF group， the combination group and the model group， 36 rats in each group. The deep second degree scald wound model was made， the rhGM-CSF group was treated with rhGM-CSF， the combination group was treated with nano silver antibacterial gel and rhGM-CSF， and no treatment was given to rats of the model group. The rate of wound healing， the number of macrophages and the number of microvessel density in each group were compared. Results At the same time， the healing rate of the rhGM-CSF group and the combination group were higher than those of the model group， and the combination group was significantly higher than the rhGM-CSF group， the difference were statistically significant （P<0.05）. The number of macrophages in the combination group on the 3， 11， 14d were less than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. The number of microvessels in the combination group on the 3， 7， 11d were significantly higher than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. Conclusion The effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF treatment was exact， and can promote the healing of scalded wounds by affecting the number and angiogenesis of burn wounds.
Key words： nanosilver antibacterial gel； recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor； burns； macrophages； microvascular
烫伤通常可造成人体皮肤组织损伤，形成烫伤创面，其中以深Ⅱ度烫伤最为常见，深Ⅱ度烫伤会损伤到真皮乳头层以下到达真皮深层，临床愈合情况变异系数较大，如果处理不当就会出现炎症反应，血管生成延缓，进而影响愈合。巨噬细胞是炎症反应的直观指标，CD68在巨噬细胞中表达，常常被作为巨噬细胞的可靠标记[1]。CD34是一种跨膜糖蛋白，在血管内皮细胞中能够稳定表达，所以常常用来计算组织微血管密度，从而对毛细血管新生情况进行有效评估[2]。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子凝胶作为一种全新的促进创面愈合的方法应用于烫伤创面，能够提高粒细胞的吞噬细菌能力，纳米银是一种长效抗菌剂，安全性高、效力持久。本研究通过观察纳米银抗菌凝胶联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor， rhGM-CSF）对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合、巨噬细胞数量以及微血管再生的影响，为临床换药治疗提供数据支撑。
1 资料和方法
1.1 主要仪器和试剂：恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司），光学显微镜（上海光学仪器一厂），纳米银抗菌凝胶（武汉东信医药科技有限责任公司），rhGM-CSF凝胶剂（长春金赛药业有限责任公司）。兔抗CD68和CD34多克隆抗体（武汉转导生物科技发展有限公司）。
1.2 大鼠深Ⅱ度烫伤创面构建和分组：健康SD大鼠114只（6只作为非烫伤正常对照组），雌雄各半，体重190～200g，自上海邦耀生物科技有限公司采购，采用普通饲料进行分笼喂养，环境相对湿度50%～70%，温度（25±2）℃，适应性喂养1周。采用1%戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射麻醉，硫化钠对大鼠背部和腿部褪毛，温水洗去脱毛剂，取仰卧位将大鼠脱毛处置于带侧支的圆底烧瓶口上（内径25mm，瓶口温度98℃），蒸汽熏蒸10s，造成5% TBSA深Ⅱ度烫伤模型。
模型制作成功后，按照随机数字法则分为3组，每组36只（雌雄各半），3组大鼠烫伤创面换药前均采用无菌棉棒蘸取0.1%醋酸氯已定溶液进行擦拭，然后再用生理盐水进行擦拭，最后用干棉棒擦干，rhGM-CSF组大鼠创面涂抹rhGM-CSF，联合组应用纳米银抗菌凝胶和rhGM-CSF涂抹，模型组不作任何处理。烫伤后每天换药1次直至创面愈合，各组小鼠正常进食水。正常对照组不作任何处理。
1.3 检测指标
1.3.1 创面愈合情况：采用高分辨率相机对创面进行拍照，保持拍摄角度和创面垂直，焦距相等，然后采用Photoshop像素法精確测定创面愈合率。创面愈合率=（初始创面面积-未愈合创面面积）/初始创面面积×100%。
1.3.2 免疫组织化学检测创面巨噬细胞数量和微血管密度：在烫伤模型建立第1、3、7、11、14、17天，每个时间点各组均取6只大鼠（雌雄各半）处死，无菌操作，取创面标本，保留创缘部分正常皮肤，立即置于10%福尔马林溶液中固定24h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，置于4℃冰箱中保存备用，进行巨噬细胞和微血管密度检测。
将石蜡切片，放入40%酒精中，水浴40℃，4min，展开，置于60℃烘箱烘片。二甲苯脱蜡，梯度酒精进行水化，高温高压组织修复，加入3%双氧水，室温中10min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，加入5%羊血孵育30min，除去封闭液，加入一抗（兔抗CD68进行巨噬细胞标记，CD34标记血管内皮细胞），置于4℃冰箱过夜，次日取出使用PBS冲洗，滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃放置20min，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃放置20min，加入DAB显色观察。巨噬细胞计数：依据DIPICTRO标准，随机选择5个视野，取其平均值作为创面巨噬细胞数量。微血管计数：参照Weidne标准，选择5个血管丰富且不重复的视野观察，在高倍镜下计数。
1.4 统计学分析：所有数据均于SPSS 16.0软件中统计分析，计量资料采用平均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组大鼠创面不同时间点愈合情况比较：随着时间的增加，三组大鼠创面愈合率均不断增加。同一时间点，rhGM-CSF组和联合组愈合率均高于模型组，且联合组愈合率显著大于rhGM-CSF组差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 三组大鼠创面不同时间点组织巨噬细胞数量检测结果：三组大鼠创面巨噬细胞数量均是先增加后减小。联合组第3、11、14天创面浸润巨噬细胞数量均少于模型组和rhGM-CSF组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图1。
2.3 三组大鼠创面不同时间点组织微血管数量检测结果：三组大鼠创伤后第3、7、11、14、17天微血管数量均高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。三组大鼠创面微血管数量伤后1～7d递增，之后开始下降，在第3、7、11天，联合组微血管数量显著高于模型组和rhGM-CSF组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3、图2。
3 讨论
深Ⅱ度烫伤创面作为烫伤领域研究的热点，引起了临床医务工作者和科研工作者的广泛关注。深Ⅱ度烫伤创面的愈合是一个复杂但有序的过程，需要在自身机体内各种诱导和调控下进行，需要经历血管反应（止血和凝血）、细胞炎症反应、增殖及修复等过程[3]。
在创面修复过程中，巨噬细胞作为主要细胞，参与到愈合过程中的各个阶段。研究表明在正常皮肤组织中，巨噬细胞均处于活化状态，只有在外界譬如烫伤等刺激作用下才会激活。但其在烫伤愈合过程所起作用意见不一，有学者[4]认为巨噬细胞的存在可以促进创伤愈合，而有学者[5]则认为巨噬细胞会引起炎症反应，从而延迟创面愈合。有研究报道烫伤后创面的巨噬细胞偏向M1型，因此细胞开始大量分泌促炎因子TNF-α， 而抗炎因子IL-10水平下降。据报道[6]，在创面发生感染或创面条件不可控时，巨噬细胞炎性反应就会增强，从而加重烫伤程度，延迟愈合。而纳米银抗菌凝胶采用纳米技术，将银离子制成纳米级颗粒，缓慢释放，持续杀菌，避免了创面细菌侵入内部发生感染，且也有报道称纳米银可以对巨噬细胞进行诱导或优化，从而促进抗炎因子的分泌。研究表明[7]中性粒细胞在烫伤创面浸润可以迅速清除坏死组织，rhGM-CSF能够促进中性粒细胞活化，增强其分泌功能，有利于创面细胞碎片和病原体的清除。本研究采用纳米银抗菌凝胶联合rhGM-CSF对深Ⅱ度烫伤大鼠进行治疗，其愈合率显著高于rhGM-CSF单一用药组，这可能是纳米银抗菌凝胶抑制了细菌侵入，避免了创面感染，同时rhGM-CSF促进清除病原体，两者联合作用，缩短了愈合周期。通过免疫组织化学法检测烫伤创面巨噬细胞，结果显示其数量先增加后减少，处在动态变化趋势，这可能和趋化因素以及创面缺乏机械屏障有关。烫伤后，联合组各个时间点巨噬细胞数量均比模型组和rhGM-CSF组要少，提示，联合用药对烫伤后创面巨噬细胞的数量有一定的影响，可以将创面局部巨噬细胞数量控制在一定范围参与愈合。
研究表明[8-9]，血管生成参与到许多病理和生理过程当中，尤其在创面愈合过程中，需要充足大量的新生血管，为创面组织提供营养的氧气，从而促进创面愈合。有研究报道[10]称新生血管障碍或者发生延迟是创面延迟愈合的主要原因，如果创面血管数量增加，创面愈合时间就会缩短。本研究结果显示在第1、3、7和11天，联合组微血管数量均高于模型组和rhGM-CSF组，且在第3、7和11天，rhGM-CSF组微血管数量比烫伤模型组多。提示纳米银抗菌凝胶和rhGM-CSF能促进血管生成，联合用药其促进血管生成能力更强。
综上所述，纳米银抗菌凝胶和rhGM-CSF联合用药治疗深Ⅱ度烫伤效果确切，且纳米银抗菌凝胶可以通过影响烫伤创面巨噬细胞数量和微血管生成来影响烫伤创面的愈合。
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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-02-28
編辑/朱婉蓉
