... X线显示髋臼发育缺欠程度及位置
刘翼天 嵇波 苏杭 葛云鹏 王丹 赵国桢 Reiko Sakurai
[摘要] 目的 觀察电针“足三里”穴对孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺功能、肺指数和肺组织形态学的影响。 方法 将20只成年SD雌鼠采用随机数字表法分为生理盐水组（S组）、生理盐水加电针“足三里”组（S+ST36组）、尼古丁组（N组）、尼古丁加电针“足三里”组（N+ST36组），采用皮下注射尼古丁注射液[1 mg/（kg·d），100 μL]造模，从妊娠第6天至新生鼠出生后21 d，用动物肺功能分析系统检测各组新生鼠肺功能，根据肺组织重量和体重计算各组新生鼠肺指数，采用HE染色法观察各组新生鼠肺组织形态学变化。 结果 与S组比较，N组呼气峰值（PEF）、肺动脉顺应性（Cdyn）显著降低（P < 0.05），气道阻力（RL）显著增高（P < 0.05），肺指数显著降低（P < 0.05）；新生鼠肺组织中肺泡数明显减少，肺泡体积增大，部分肺泡壁破裂相互融合。与N组比较，N+ST36组PEF、Cydn显著升高（P < 0.05），RL显著降低（P < 0.05），肺指数显著升高（P < 0.05）；新生鼠肺组织中肺泡数量增多、肺泡面积减小和肺泡壁破裂融合情况减少。 结论 电针孕期和哺乳期尼古丁暴露大鼠“足三里”穴可能通过改善新生鼠肺功能、肺指数及肺组织形态学变化发挥对新生鼠肺发育的保护效应。
[关键词] 孕期及哺乳期尼古丁暴露；足三里；肺指数；肺功能；肺组织形态学
[中图分类号] R246.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-00040-05
[Abstract] Objective To observe the effects of electroacupuncture at “Zusanli” points on lung function， lung index and lung morphology of neonatal rats exposed to nicotine during perinatal period. Methods Twenty adult female SD rats were divided into normal saline group （S group）， normal saline plus electroacupuncture at “Zusanli” group （S + ST36 group）， nicotine group （N group） and nicotine plus electroacupuncture at “Zusanli” group （N + ST36 group） by random number table. The model was established by subcutaneous injection of nicotine [1 mg/（kg·d）， 100 μL] from gestational day 6 to postnatal day 21. The lung function of neonatal rats was detected by animal lung function analysis system. The lung index was calculated according to the weight and weight of lung tissue， and the morphological changes of lung tissue in newborn rats were observed by HE staining. Results Compared with group S， the PEF and Cydn in group N were significantly decreased （P < 0.05）， RL was significantly increased （P < 0.05） and lung index was significantly decreased （P < 0.05）. The numbers of alveoli in group N decreased obviously， and the volume of alveoli increased and part of alveolar wall ruptured and fused with each other. Compared with group N， PEF and Cydn in group N + ST36 were significantly increased （P < 0.05）， RL was significantly decreased （P < 0.05） and lung index was significantly increased （P < 0.05）. The number of alveoli in group N + ST36 increased， and the volume of alveoli decreased and the rupture and fusion of alveolar wall were improved. Conclusion Electroacupuncture at “Zusanli” points can protect lung development by improving lung function， lung morphology and lung index of newborn rats exposed to nicotine during perinatal period.
[Key words] Perinatal nicotine exposure； Electroacupuncture； Lung function； Lung morphology； Lung index
《2012年中国吸烟危害健康报告》显示，我国吸烟人群超过3亿，而被动吸烟人数多达7.4亿，主要受害者是妇女和儿童，超过50%的育龄妇女遭受二手烟危害[1]。孕妇直接或被动吸烟对胎儿及新生儿均可以诱发多方面的损伤，尤其对子代肺功能和结构能产生不良的影响[2-4]，对此人们常采用糖皮质激素治疗，但是其有效率受限和副作用等问题一直未得到解决[5-6]。因此，寻求一种安全、有效的治疗方法一直是医学领域关注的热点。古籍和现代研究均认为，针灸足三里穴能增强机体的自我调节修复功能，可用于多系统疾病调治[7-9]，尤其发现针刺足三里穴具有良好的内分泌和免疫调节作用，同时可以调治呼吸系统疾病[10-12]。本研究借助孕期及哺乳期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）诱发新生鼠肺发育不良模型，观察电针孕期及哺乳期大鼠“足三里”穴后新生鼠肺功能、肺指数及肺组织形态学的变化，明确电针“足三里”穴对孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺发育不良影响的效应。
1 材料与方法
1.1 动物
选用SPF级成年SD大鼠，周龄均为11周，雌鼠20只，均未经产，雄鼠7只，均由北京维通利华实验动物技术公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2006-009。操作过程在北京中医药大学SPF级动物研究中心标准Ⅱ级动物房操作。室温为（23±1）℃，相对湿度为（45±5）%，12/12 h昼夜节律。本项研究的动物实验过程均遵守美国国立卫生院倡导的实验动物关怀和使用指导原则，及以减少、替代、优化为核心的动物实验“3R”原则，并且本动物实验通过北京中医药大学伦理委员会审查，编号：3-2017020921-1021。
1.2 主要试剂和仪器
尼古丁（美国Sigma公司，批号：BCBR5093V）；多聚甲醛（天津市福晨化学试剂厂，批号：20140427）；二甲苯（北京化工厂，批号：20150911）；蔗糖（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170406）；无水乙醇（北京化工厂，批号：20160113）；华佗牌无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）规格：0.20 mm×13.00 mm；二导HAN′s穴位刺激仪器（LH202H，北京华卫产业开发有限公司）；AniRes2005动物肺功能分析系统；BT223S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；自动化智能型正置研究级显微镜TX51[奥林巴斯（中国）有限公司]。
1.3 分组
所有大鼠适应性饲养1周后，雌性大鼠按随机数字表法分为4组，即生理盐水组（S组）、生理盐水加电针“足三里”组（S+ST36组）、尼古丁组（N组）、尼古丁加电针“足三里”组（N+ST36组），每组各5只大鼠。
1.4 合笼并光学显微镜下观察阴道涂片情况
雌鼠与雄鼠3∶1合笼交配，次日用光学显微镜观察阴道涂片，发现精子当日记为受孕0 d，雌鼠怀孕后单笼饲养。
1.5 造模方法
按照Rehan等[13]制备疾病模型的方法，从受孕第6天起，开始皮下注射尼古丁，每只1 mg/（kg·d），100 μL，至妊娠结束前1 d；在生产当天停止注射，之后继续注射尼古丁给母鼠，至子代大鼠出生后第21天。
1.6 实验动物分组处理方法
S组：注射生理盐水，注射量、注射方式和时程同N组。
S+ST36组：注射生理盐水配合电针“足三里”穴治疗。生理盐水注射方法同S组。取穴方法参照《实验针灸学》[14]描述。从受孕第6天起，一直到子代大鼠出生后第21天。用华佗牌0.20 mm×13.00 mm毫针分别针刺双侧“足三里”穴（直刺7mm，接电针负极）及双侧“足三里”穴下方2 mm处（毫针刺入皮下，接电针正极），电针频率2/15 Hz，强度1 mA。电针治疗20 min，每日1次。
N组：见“1.5造模方法”。
N+ST36组：尼古丁注射配合电针“足三里”穴治疗。尼古丁注射方法同N组，电针治疗方法同S+ST36组。
每组取8只子代大鼠进行检测。
1.7 肺功能检测
子代大鼠出生21 d行肺功能检测。定标后称重大鼠，用2%戊巴比妥钠腹腔注射（注射剂量为55 mg/kg）麻醉后3～5 min，固定，于颈部正中行气管切开，用镊子暴露出气管，在第三、四气管环中间做倒T型切口并插管，之后用手术线系紧插入气管的插管。之后把大鼠放入体描箱，连接呼吸机。待呼吸稳定后，进行RC标记，用AniRes 2005软件导出大鼠的呼气峰值（PEF）、气道阻力（RL）、肺动脉顺应性（Cdyn）进行分析。
1.8 标本采集及肺指数计算
腹主动脉放血后，迅速开胸，分离肺脏，剔除气管及血液称肺湿重。根据动物体重和肺湿重计算肺指数。肺指数=肺重（mg）/体重（g）×100%。
1.9 肺灌注及组织形态学观察
子代大鼠出生21 d后，以2%戊巴比妥钠麻醉新生鼠，取血后开胸，取整个肺和心脏，用注射器从气管注射4%多聚甲醛使肺充盈，并用绳子结扎，浸泡在多聚甲醛中，4～5 h后将肺、心脏用PBS冲洗两次；浸泡在已经过滤的30%的蔗糖溶液中，前3 d每天换1次蔗糖，第3天切除心脏；之后每2天换1次蔗糖，直到肺组织全部沉到瓶底。将肺组织取出，石蜡包埋后，5 μm厚切片，HE染色后，在200倍光镜下观察肺泡化程度。
1.10 统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用單因素方差分析，方差齐性检验方差齐后，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 电针“足三里”穴对PNE新生鼠肺功能的影响
2.1.1 对PEF的影响 与S组比较，S+ST36组无明显变化（P > 0.05），而N组显著降低（P < 0.05）；与N组比较，N+ST36组显著升高（P < 0.05）。见图1。
2.1.2 对RL的影响 与S组比较，S+ST36组无明显变化（P > 0.05），而N组显著升高（P < 0.05）；与N组比较，N+ST36组显著降低（P < 0.05）。见图2。
2.1.3 对Cydn的影响 与S组比较，S+ST36组无明显变化（P > 0.05），而N组显著降低（P < 0.05）；与N组比较，N+ST36组显著升高（P < 0.05）。见图3。
2.2 电针“足三里”穴对PNE新生鼠肺指数的影响
与S组比较，S+ST36组无明显变化（P > 0.05），而N组显著降低（P < 0.05）；与N组比较，N+ST36组显著升高（P < 0.05）。见图4。
2.3 电针“足三里”穴对孕期和哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺组织形态学的影响
光镜下观察，与S组比较，S+ST36组新生鼠肺组织中肺泡数稍增多，N组新生鼠肺组织中肺泡数明显减少，肺泡体积增大，部分肺泡壁破裂相互融合；与N组比较，N+ST36组新生鼠肺组织中肺泡数量增多，肺泡面积减小，肺泡壁破裂融合有所改善。见图5。
3 讨论
尼古丁是烟草中脂溶性较高的生物碱，可被快速吸收并能透过胎盘在胎儿体内蓄积，被认为是烟草中危害胎儿健康的主要毒性成分[15]；同时，有证据证实尼古丁可在吸烟母亲的母乳中聚集[16]。因此，妇女孕期和哺乳期抽烟可导致尼古丁通过胎盘或乳汁进入胎儿及新生儿体内，影响胎儿生长发育。PNE对后代多系统均可产生不良影响，如呼吸系统、神经系统、心血管系统、内分泌系统等[17-21]，尤其是对呼吸系统影响明显，可导致肺发育不良，对此治疗多用糖皮质激素，但有效率有限且副作用较大。因此，探寻一种安全、有效的干预措施是一个亟待解决的难题。
本研究采用Rehan等[13]皮下注射尼古丁的方法造模，也是目前国际上比较公认的模型制备方法。给予1 mg/kg的尼古丁注射大约相当于成人（60 kg）每天吸食5支香烟的尼古丁摄入量[22]，既能很好地复制人类孕期及哺乳期吸烟导致新生儿肺发育不良的模型，又不会引起大鼠及胎儿的死亡。
足三里穴是强身保健的要穴，具有理脾胃、调气血、补虚弱、宣畅气机等诸多功效。《针灸大成》中记载足三里“诸病皆治”，《外台秘要》记载：“三里养后天之气，灸三里可使元气不衰”，说明足三里穴具有全身强壮的作用。现代研究认为，针灸足三里穴具有良好的免疫调节作用，且这种作用具有整体性和双向性[12-14]。古今大量的实践都证实，足三里不仅可以健脾和胃，用于脾胃、肠腑疾病的治疗，还能够调动、激发或维持机体的自身功能而防病治病。此外，古籍和现代研究均认为足三里穴对肺系疾病具有良好的调治作用[15-17]。因此，足三里是一个能防治多种疾病，强身健体的重要穴位。本研究不是治疗母鼠的呼吸系统疾病，而是为了通过干预母鼠达到保护新生鼠肺发育的目的。因此，本研究选取电针母鼠“足三里”穴，观测是否可以通过增强机体的自我调节修复功能，对PNE新生鼠肺发育不良有保护作用。
大量研究表明，孕期尼古丁暴露可显著降低后代PEF，增加RL，降低Cydn[2-3]。RL与呼吸功能关系密切，RL增大与多种呼吸系统疾病有直接关系；Cydn与肺组织弹性和RL有关，当肺组织弹性降低或RL增加时，Cydn会降低；而PEF是反映气道通畅性的一个重要指标。本研究发现，PNE新生鼠PEF显著降低、RL显著增高、Cydn显著降低，而电针“足三里”穴可显著升高PNE新生鼠PEF和Cydn，并显著降低RL，说明电针“足三里”穴可以通过降低RL、提高Cydn改善PNE新生鼠的肺功能。Ji等[23]研究结果表明，电针PNE大鼠“足三里”，可以显著升高新生鼠PPAR-γ水平，降低β-catenin水平，因此电针“足三里”保护新生鼠肺功能的作用可能通过上调PPAR-γ或下调β-catenin通路来实现的。
肺泡是肺部气体交换的主要部位，也是肺的功能单位，肺泡结构异常则会影响肺换气功能。Maritz等[4]在研究孕期尼古丁暴露对后代气体交换的影响时发现，孕期尼古丁暴露可使二代鼠的肺泡数和隔膜中的毛细血管数目显著降低。本研究发现，PNE新生鼠肺组织中肺泡数明显减少，肺泡体积增大，部分肺泡壁破裂相互融合，与Maritz等[4]结果一致。而电针母鼠“足三里”穴后，孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺组织中肺泡数量增加，肺泡面积减小，肺泡壁破裂融合有所改善，说明电针“足三里”穴可以通过改善PNE引起的新生鼠肺结构改变，进而改善气体交换功能，从而保護子代大鼠肺发育损伤。Sekhon等[2]研究发现，孕期尼古丁暴露导致肺发育不良的二代猴肺的绝对重量和相对重量（每100克体重的肺重量）分别降低16%和14%。本研究发现孕期和哺乳期尼古丁暴露后新生鼠肺指数显著降低，与Sekhon等[2]结果一致，而电针“足三里”穴可显著升高孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠的肺指数，说明电针“足三里”穴可以促进孕期及哺乳期尼古丁暴露新生鼠肺部发育。
综上所述，电针孕期和哺乳期大鼠“足三里”穴可以通过改善新生鼠肺功能、肺指数及肺组织形态学变化发挥对新生鼠肺发育的保护效应，具体调解途径和发生机制尚需要进一步探讨。
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