羟基喜树碱对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成及Smad7表达的影...
蒋朝龙 史高峰 李虎 高凤山
[摘要]目的：研究甲基莲心碱对增生性瘢痕成纤维细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3 中mRNA和蛋白表达的影响。方法：体外培养增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤组织，随机分为4组：对照组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（5、10、20μg/ml）。各组分别加入不同浓度药物培养24h后，采用RT-PCR检测Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表达，并运用Western Blot检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达。结果：与对照组相比，低剂量组Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表达量均无明显变化（P>0.05）；中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显降低，Bax及Caspase-3 mRNA表达量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，低剂量组Bcl-2蛋白表达量无明显变化，中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；低、中、高剂量组Bax及Caspase-3蛋白表达量均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：甲基莲心碱能上调增生性瘢痕成纤维细胞中Bax、Caspase-3的表达，同时下调Bcl-2的表达。
[关键词]甲基莲心碱；增生性瘢痕成纤维细胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）03-0107-03
Research of Influence of Neferine on Expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in Hypertrophic Scar Fibroblast
JIANG Zhao-long，SHI Gao-feng，LI Hu，GAO Feng-shan
（Department of Plastic Surgery，Affiliated Hoapital，Jiangnan University，Wuxi 214062，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To research the influence of neferine on the expression of mRNA and protein in Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast. Methods Hypertrophic scar fibroblasts and normal skin tissue were cultured in vivo and randomly divided into four groups， namely， the control group， low， medium and high dose groups of neferine（5，10，20μg/ml）. After drugs with different concentrations are respectively added into each group for culture for 24 hours， the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA was detected by RT-PCR， and the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 protein was detected by Western Blot. Results Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA in the low dose group（P>0.05）. The expression of Bcl-2 in medium and high dose group decreased obviously， and the expression of Bax and Caspase-3 significantly increased（P<0.05）. Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2 protein in the low dose group， and the expression of Bcl-2 in the middle and high dose groups decreased significantly（P<0.05）. And the expression of Bax and Caspase-3 in the low， middle and high dose groups increased obviously（P<0.05）. Conclusion Neferine can upregulate the expression of Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast and downregulate the expression of Bcl-2 therein as well.
Key words： neferine； hypertrophic scar fibroblasts； Bcl-2； Bax； Caspase-3
增生性瘢痕（Hypertrophic Scar）往往由手術、外伤及烧伤造成，发病机制与延长的炎症反应及伤口愈合增殖有关[1]。成纤维细胞增殖及凋亡异常与增生性瘢痕的形成密切相关[2]。临床治疗方法有手术切除、激光、放疗等，但毒副作用大及复发率高，故值得进一步研究其发病机制和防治药物[3]。甲基莲心碱（neferine）是从睡莲科植物莲的成熟种子绿色胚芽中提取的生物碱，属双苄基异喹啉化合物，分子式为C38H44N2O6[4]。有研究发现其能抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[5]，但其具体作用机制仍未阐明。有报道发现其能通过线粒体途径诱导HSC-T6凋亡，具体机制与Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达改变有关[4]。本实验研究甲基莲心碱对瘢痕成纤维细胞Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响，以分析其抑制瘢痕成纤维细胞的机制，为临床应用提供依据。
1 资料和方法
1.1 试剂与仪器：甲基莲心碱（CHENGDU MUST Bio-technology）；DMSO（美国Sigma公司）；marker和琼脂糖（Promega公司）；2×Taq MasterMix（康为世纪）；引物合成（北京奥科鼎盛生物技术公司）；RNA 提取试剂盒fastgen200（上海飞捷生物技术有限公司）；逆轉录试剂盒（TaKaRa）；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin 多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。CO2恒温箱（Thermo公司）；超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）；RT-PCR仪（AB Applied Biosystems）；电泳仪（美国BIO-RAD公司）；凝胶成像分析系统（培清科技）。
1.2 标本来源：增生性瘢痕组织取自江南大学附属医院整形外科的增生性瘢痕患者。均符合增生性瘢痕的临床诊断标准，术后病理诊断与临床诊断一致，且患者无长期外用抗瘢痕药物史，不合并肿瘤及其他严重疾病。同时取4例其他外科手术患者创缘的正常皮肤组织，均无结缔组织疾病，无心、肺、肝、肾等慢性疾病，近期未使用过糖皮质激素、抗肿瘤药物等，且未接受过放疗。
1.3 增生性瘢痕成纤维细胞的培养：采用组织块培养法进行增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养。取新鲜增生性瘢痕组织，用0.5%新洁尔灭漂洗2次，每次3min，再用0.9%生理盐水反复冲洗。在无菌工作台内，去除表皮及皮下组织。在少量胎牛血清中将瘢痕组织剪成0.5～1mm大小的组织块，接种于塑料培养皿中，组织块间距约0.5mm，在5%CO2，37℃饱和湿度和95%空气条件下培养4h，使组织块粘附，然后加入1640培养基（含20%小牛血清，青、链霉素各100U/ml）适量，继续培养，每3～5d换液1次。3～4周后，待原代细胞生长基本融合成片时，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1：2或1：3的比例分种传代培养，以后每3～5d传代一次。取3～6代细胞进行实验。以2×104个/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，从次日起，每天用血球计数器计数3孔细胞，计算均值。
1.4 实验分组：使用DMSO溶解甲基莲心碱。实验分为4组，即对照组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（5、10、20μg/ml）。取对数期生长细胞，培养于6孔板上，每孔加入2ml培养基，培养24h，待细胞生长至50%时，更换培养基为无血清DMEM，饥饿24h，再更换为10% FBS的DMEM，同时加入各组药物培养24h，进行RT-PCR及Western Blot实验。
1.5 RT-PCR测定各组细胞中mRNA表达水平：采用RNA提取试剂盒fastgen 200提取细胞总RNA。逆转录采用TaKaRa法，反应体系为10μl，内含500ng RNA，5×PrimeScript Buffer 2μl，最后RNase free H2O定容到10μl，按反应条件37℃ 15min，85℃ 5s 在RT-PCR仪上反应，冷却至-20℃ 保存。PCR反应体系为25μl，内含cDNA 2μl，上、下游引物各加入0.5μl（引物序列见表1），2×Taq Master Mix 12.5μl，RNase free H2O 9.5μl。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸5min，冷却至4℃保存。PCR扩增产物用20ng/L琼脂糖凝胶电泳并照相，用Gel-pro Analyzer软件进行灰度分析，以各因子条带与内参条带的光密度比值代表其mRNA相对表达水平。每个实验组重复5次。
1.6 Western Blot检测各组细胞中蛋白表达水平：收集经0、5、10、20μg/ml甲基莲心碱处理24h后的细胞，PBS洗涤，加入裂解液，置于4℃下裂解15min提取总蛋白，测定蛋白浓度并定量，用质量分数为12%的SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上，以质量分数为5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入1：500稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入1：5 000稀释的二抗，室温孵育1h，洗膜3次。应用ECL进行显影检测，以Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白与内参β-actin蛋白的IOD比值作为目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学分析：统计学分析使用SPSS 19.0软件。数据均以均数±标准差（x?±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较多组间均数差异，组间比较应用最小显著差异法（LSD-t）。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 mRNA表达量测定结果：与对照组相比，低剂量组Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表达量均无明显变化（P>0.05）；中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量明显降低，Bax及 Caspase-3 mRNA表达量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图1。
2.2 各组细胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 蛋白表达量测定结果：与对照组相比，低剂量组Bcl-2蛋白表达量无明显变化，中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，低、中、高剂量组Bax及Caspase-3蛋白表达量均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图2。
3 讨论
增生性瘢痕与创伤愈合过程中成纤维细胞过强的功能及细胞外基质的过度累积有关，组织学上其主要由平行于皮肤表面的Ⅲ型胶原构成[6]。增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性较正常皮肤来源成纤维细胞增强[7]，同时增生性瘢痕存在众多凋亡异常，如其中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达比正常皮肤组织高，增生性瘢痕来源的成纤维细胞抵抗Fas介导的凋亡等[8]。这可能导致增生性瘢痕成纤维细胞对凋亡产生抵抗，进而失控性的生成大量胶原纤维[8]。甲基莲心碱因具有抗肝脏纤维化的功能广受关注，其机制可能与其抑制肝星状细胞增殖，同时促进肝星状凋亡有关[4，9]。由于增生性瘢痕的病理生理机制与肝纤维化存在相似性，因此两者的研究往往可以相互借鉴。有研究发现甲基莲心碱能剂量依赖性地抑制体外培养瘢痕成纤维细胞的增殖，并能减少移植至裸鼠的人增生性瘢痕的体积，同时改变Ⅰ、Ⅲ型胶原成分，降低胶原和酸性粘多糖含量的作用，但目前尚无对其潜在机制的研究[5]。本研究即初步探讨了甲基莲心碱抑制瘢痕成纤维细胞增殖的机制。
本实验发现甲基莲心碱能上调增生性瘢痕成纤维细胞中Bax、Caspase-3的表达，同时下调Bcl-2的表达。而Bcl-2、Bax及Caspase-3都是细胞凋亡中的关键分子[4]。凋亡主要通过两条基本通路：死亡受体通路和线粒体通路，其中线粒体通路主要与Bcl-2家族蛋白有关[10]。线粒体中促凋亡因子的释放主要受Bcl和Bax的调控，Bcl和Bax都是线粒体膜相关的Bcl-2家族蛋白，Bcl与Bax之间的相互作用决定了细胞的生死[10]。Bcl-2是一种具有抗凋亡活性的膜整合蛋白，它能使细胞抵抗凋亡。Bax则是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，Bax从细胞浆转移至线粒体膜外层后，进而与Bcl-2蛋白组成异源二聚体，该二聚体能在线粒体上产生孔道，介导细胞色素C的释放[8]。实验中发现随着甲基莲心碱浓度的增高，Bcl-2的表达有下降趋势，其中中、高剂量组较低剂量组、对照组显著性降低；同时Bax的表达有升高趋势，3个剂量组均较对照组显著性升高。而Bcl-2的降低和Bax的增高可能通过线粒体通路促进细胞凋亡。Caspase-3作为凋亡中最重要的一个效应分子，是多种凋亡信号通路的最终汇集点，也是凋亡的主要执行者[11]。实验中随着甲基莲心碱浓度升高，细胞中Caspase-3的表达有升高趋势，且中、高剂量组与对照组、低剂量组之间的差异有统计学意义。故Caspase-3的高表达可能参与了瘢痕成纤维细胞的凋亡，这可能是甲基莲心碱抑制该细胞的潜在机制。
综上所述，甲基莲心碱能下调增生性瘢痕成纤维细胞中Bcl-2的表达，上调Bax的表达，同时显著上调Caspase-3的表达，这可能是甲基莲心碱诱导目的细胞凋亡的潜在机制。本实验仅研究了甲基莲心碱对体外培养细胞的作用，但其对体内增生性瘢痕组织中成纤维细胞的影响有待进一步研究。目前增生性瘢痕尚无理想的治疗药物，甲基莲心碱因其纯天然、毒副作用较小等优势，且符合国家近期扶植中医药发展的精神，进一步研究其抑制瘢痕成纤维细胞的机制，使其有望成为治疗增生性瘢痕的一个新选择。
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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-02-01
编辑/朱婉蓉
