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潘兴国 李荣辉 张华
[摘要] 铜绿假单胞菌（Pa）侵染人体成功后，能引起炎性反应。然而，菌体细胞表面的Ⅳ型菌毛（TFP）是致炎因子之一。菌毛的主要組成成分是PilA蛋白，一个菌毛由几千个PilA蛋白亚单位组成。PilA蛋白能够诱导宿主巨噬细胞产生IL-1β，IL-1β是宿主防御的关键炎性细胞因子，能够介导多种炎性反应，包括T细胞极化、抗体产生、发热及内皮和吞噬细胞的激活。本文综述了铜绿假单胞菌菌毛蛋白诱导IL-1β产生的研究现状。
[关键词] 铜绿假单胞菌；Ⅳ型菌毛；PilA蛋白；IL-1β
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（c）-0032-05
Research status of Pseudomonas aeruginosa pilus induce IL-1β
PAN Xingguo1* LI Ronghui2* ZHANG Hua2
1.Department of Labroatory Medicine， Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563099， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Guizhou Provincial People's Hospital， Guizhou Province， Guiyang 550002， China
[Abstract] Pseudomonas aeruginosa can induces inflammatory response after successful infection on the host. However， the surface of the bacterial Type Ⅳ Pili is one of the inflammatory factors. The main composition of the pilus is PilA. One pilus is made up of thousands PilA subunits. PilA can induce host macrophages to produce IL-1β， IL-1β is a key important inflammatory cytokine in host defence which mediates a diverse range of effects， including T-cell polarization， antibody production， fever and endothelial and phagocyte activation. This paper summarizes the research status of pseudomonas aeruginosa pilus induce IL-1β.
[Key words] Pseudomonas aeruginosa； TypeⅣ Pili； PilA； IL-1β
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为革兰阴性菌，是造成医院内感染的主要病原菌之一，是一种临床上常见的引起严重获得性感染的条件致病菌。可使人体多个部位和组织发生感染，如中耳、角膜、尿道、呼吸道、心内膜和胃肠道等[1]。可引起大面积烧伤或创伤患者创口感染化脓；引起婴儿严重的流行性腹泻；它也是使慢性阻塞性肺病加重的常见原因；身体虚弱、机体免疫力低下或患有其他严重的疾病的患者可继发感染该菌，出现败血症而造成生命危险。由于该菌自身对多种药物有耐药性，且生长过程中可获得对敏感药物的抗性，加上很多患者免疫力低下，或创伤严重，从而增加慢性感染的可能性，对于慢性感染患者，使用抗生素虽然可以暂时缓解症状，但是菌体及其产生的致炎因子并未完全消除，机体产生持续及过多的炎性反应会导致非常严重的疾病，如急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征[1]。所以有效地控制该菌的感染及机体过度的炎性反应是非常紧急和必要的，因此，研究清楚铜绿假单胞菌菌毛蛋白与宿主的作用机制成为当务之急。
1 铜绿假单胞菌菌毛及菌毛蛋白
菌毛（pilus）是许多革兰阴性菌及少数革兰阳性菌菌体表面遍布的比鞭毛更为细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属物，也叫纤毛（fimbriae），所有的革兰阴性菌的表面都有Ⅳ菌毛（Type Ⅳ Pili），由菌毛蛋白单体聚合而成，每个菌毛蛋白单体的受体结合位点都在C端的二硫键环上，但是其具有功能的结合位点仅仅只在菌毛的顶端。Ⅳ型菌毛是许多病原菌表面的重要毒力因子，参与多种功能，包括黏附、蠕动、生物膜形成、水平基因转移等[2]。铜绿假单胞菌Ⅳ型菌毛的功能非常重要，包括微菌落和生物膜形成、寄主细胞粘附、细胞信号传导、通过自然转化和噬菌体附着来摄取DNA。Ⅳ型菌毛也是铜绿假单胞菌的重要毒性因子[3]。菌毛与运动无关，在光镜下看不见，使用电镜才能看见。菌毛可以分为普通菌毛（commonpilus）和性菌毛（sexpilus）两种，普通菌毛长0.3～1.0 μm，直径7 nm。性菌毛比普通菌毛粗，中空呈管状。前者与细菌吸附和侵染宿主有关，后者与传递遗传物质有关。铜绿假单胞菌菌毛黏附在菌体表面上，菌毛直径大概5.4 nm，平均长度2.5 μm[4]，菌毛在在细菌的致病性中扮演了许多角色，在细菌机会感染上起着巨大的作用。铜绿假单胞菌产生的黏附因子能吸附在上皮细胞上，这样有助于病菌毒力发挥作用，如：吸附在人类肺A549 cells的黏附因子中，纤细柔软的Ⅳ菌毛占有约90%。菌毛还可以激发宿主的免疫反应，是潜在药物疫苗的治疗靶点[5]。理论上来讲，研发疫苗来阻止菌毛的黏附就可以预防此菌对人体的感染，但是不能用菌毛疫苗进行免疫接种，因为不同的菌株产生不同的并且有时是高度趋异进化的菌毛蛋白变体。
菌毛蛋白（Pilin）是菌毛的化学组成成分，而在铜绿假单胞菌菌毛中Ⅳ型菌毛是最主要的致炎因子之一，Ⅳ型菌毛的主要组成成分是PilA蛋白[6]，一个菌毛由几千个PilA蛋白亚单位组成。PilA二级结构从N端到C端分别为：延长的α-螺旋（α1）、αβ环、αβ片层及D（disulde-bonded loop）区，D区两侧为两个保守的半胱氨酸残基。成熟PilA蛋白的N端序列是高度保守的，此区被认为是PilA蛋白之间相互作用的区段，使菌毛蛋白连接形成螺旋四级结构。相比之下，其余的氨基酸序列不太保守，尤其是D区（菌株PAO1中，位于PilA蛋白的第135-147位氨基酸残基）（图1）。
PilA蛋白可通过其D区及附近区段结合真核细胞膜糖脂受体asialo-GM1（neutral glycolipid gangliotetraosyl-ceramide）[7]，此区段被称为C端受体的结合域。在菌株PAO中PilA的C端受体结合域单点突变K130I后，菌毛对人类的口腔上皮细胞的结合则增强。因此，C端受体结合域对菌毛与不同表面的结合有重要作用。PilA蛋白含有KSTQD模体，位于D区，这种类似结构域存在于一些与人类8 kD动力蛋白轻链1型DYNLL1（cytoplasmic dynein light chain1）蛋白相互作用的病原相关蛋白中，如人类腺病毒蛋白酶、BimEL、MAP4、狂犬病毒P蛋白、莫科拉病毒P蛋白、人类疱疹病毒1（HHV-1）的复制起始结合蛋白UL9、人类单纯疱疹解旋酶及桑灯蛾昆虫痘病毒AMV179开放阅读框[8]。DYNLL1是动力蛋白的亚单位，含有两个结合位点，参与蛋白分子转运，可以特异的结合（K/R）XTQT模体，从而能结合多种目的蛋白，并进行转运。有学者利用多种分子对接方法AUTODOCK、PatchDock、ZDOCK、DOCK/PIE？鄄RR或CLUSPRO，通过分子动力激活测验及电脑模拟技术判断出DYNLL1与PilA很可能有相互作用[4]。
PilA蛋白能激活小鼠巨噬细胞中的炎症小体，使非活化状态含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-1）前体经过蛋白质酶解之后变为有活性的caspase-1，有活性的caspase-1再对非活化状态的IL-1β前体（pro-IL-1β）进行切割，使之变为成熟有活性的IL-1β并从细胞中释放出来[5]。
2 IL-1β的介绍
2.1 IL-1β的概述
IL-1β是IL-1家族中的成员之一，IL-1是先天免疫和炎症的中间介质，是第一个被认知的白介素。在IL-1家族中IL-1β是被研究得最多的成员，因为它可以调解人体自身炎症疾病，同時IL-1β也是IL-1家族的最重要的成员[9]。IL-1β是寄主防御的关键炎性细胞因子，能够介导多种效应，包括T细胞极化、抗体产生、发热及内皮和吞噬细胞的激活[10-11]。IL-1β合成初期是一种非活化的前体形式pro-IL-1β，其经过caspase-1蛋白酶解加工后才形成成熟的活化形式，随后从细胞中释放出来[12]。caspase-1最初也是一种非活化状态的前体，需要蛋白质酶解过程使其活化，该活化过程是由细胞质中的多亚基蛋白复合物即炎症小体严格控制[13]。多种刺激因子能够激活炎症小体，导致caspase-1酶原的蛋白质酶解，从而成为活化形式，活化后使细胞因子前体pro-IL-1β变为IL-1β，并从细胞中释放，在此过程中经常伴随着细胞程序性死亡[14]。
2.2 IL-1β和IL-1α之间的差异
IL-1β和IL-1α虽然是由不同的基因所编码，但是他们都含有相同的受体（IL-1R），并且有相似的生物学特征[15]。然而它们的不同之处在于所存在的部位和对免疫、炎症、癌症的影响。IL-1α的前体存在于全部的胃肠道、肺脏、肝脏、肾脏、内皮细胞、星形胶质细胞的上皮层。当细胞坏死的时候IL-1α的前体就被释放出来。在无菌炎症中，IL-1α的前体非常的活跃而且能快速主动的产生具有报警素功能的炎症细胞因子和趋化因子。因此IL-1α调节的是无菌炎症的早期阶段。与之相比，IL-1β由单核细胞、组织巨噬细胞、皮肤源性胶质细胞、大脑小神经胶质细胞产生。与IL-1α前体不同的是，IL-1β前体没有活性而需要靠caspase-1激活再释放具有活性功能的IL-1β进入细胞外间隙中引起炎性反应。
2.3 TLR 家族和IL-1家族之间的差异
IL-1家族包括7个激动活性的配体（IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、β和γ），3个受体拮抗体（IL-1Ra、IL-36Ra、IL-38）和一个抗炎细胞因子（IL-37）。IL-1家族受体成员包括6个受体链形成的4个信号受体复合物，2个诱骗受体（IL-1R2、IL-18BP）和2个负调节物（TIR8或SIGIRR，IL-1RAcPb）[15-16]。IL-1家族受体总共有11个，分别为：IL-1R1（IL-1RI）、IL-1R2（IL-1RII）、IL-1R3（IL-1RAcP）、IL-1R4（ST2）、IL-1R5（IL-18Ra）、IL-1R6（IL-1Rrp2、IL-36R）、 IL-1R7（IL-18Rβ）、 IL-1R8（TIR8，又名SIGIRR）、IL-1R9（TIGIRR-2）、IL-1R10（TIGIRR-1）。受体链的一般特征是在细胞外由3个免疫球蛋白样结合域组成。通过受体拮抗受体、诱骗受体和信号传导抑制剂的严谨调节来确保内在免疫和不可控炎症之间能达到一个平衡。IL-1家族中每个成员配体的活动都受它自身受体的调解，每个配体特异地结合在含有3个免疫球蛋白样区域的配体结合链上[17]。Toll样受体（TLRs）与内在免疫传感器的膜紧密的联系在一起，能识别病原体对机体的入侵。他们也能监测与宿主危险相关的物质或报警素，例如高迁移率族蛋白（HMGB1）[18]。然而内源性RNA和DNA通常是隐藏在TLRs无法接触到的地方，当细胞受到压迫、炎症、感染，他们就会暴露出来而被识别。TLRs表达于巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮和内皮细胞。TLR1、TLR5、TLR6和TLR10表达于细胞表面，TLR3、TLR7～9、TLR11表达于细胞核中，TLR2和TLR4在细胞表面与细胞核中都能表达[19]。和其它任何的细胞因子相比IL-1家族和人体的先天性免疫联系得更紧密，当发现胞浆中IL-1的Ⅰ型受体与TLRs具有很高的同源性的时候这种联系变得更明显。IL-1受体的每个成员和TLR家族的每个成员中都含有Toll样IL-1受体（TIR）域。50个氨基酸的TIR域与果蝇的Toll蛋白高度同源。在TLR家族和IL-1受体家族的每个成员中，TIR几乎相同。IL-1家族细胞因子通过IL-1受体家族引发先天炎症，而TLRs通过细菌、微生物产物、病毒、核酸和损伤相关的分子模式（DAMPs）引发炎症[20]。尽管TLR 家族和IL-1家族都可以帮助人体防御感染，然而不同于TLR家族的是IL-1家族还可以抑制炎性反应。
3 铜绿假单胞菌菌毛蛋白诱导IL-1β产生的机制
3.1 IL-1β的产生
铜绿假单胞菌菌毛蛋白PilA能够诱导小鼠巨噬细胞产生IL-1β[6]，即铜绿假单胞菌菌株PA103ΔUΔT侵染小鼠巨噬细胞后，PilA蛋白通过NLRC4蛋白激活炎症小体，从而激活caspase-1，导致成熟的1L-1β的分泌，此过程依赖于细菌三型分泌系统（TTSS），而不是其他任何分泌毒素[21]。分泌毒素有胞外酶S（ExoS）、胞外酶T（ExoT）、胞外酶U（ExoU）、胞外酶Y（ExoY）等。当铜绿假单胞菌侵染人体后，ExoU是损伤肺泡上皮细胞的最主要的毒力因子[22]。大多数革兰阴性细菌能激活NLRC4炎症小体，这是完全依赖于细菌的三型分泌系统（TTSS）。然而将菌株PA103ΔUΔT分泌液中提取纯化的菌毛蛋白及利用大肠埃希菌E.coli获得的重组菌毛蛋白用脂质体转染小鼠巨噬细胞后能激活caspase-1，导致成熟的1L-1β的分泌[5]，而不依赖于NLRC4、NLRP3或ASC蛋白。
3.2 三型分泌系统（TTSS）的作用
三型分泌系统（TTSS）激活炎症小体的机制是革兰阴性细菌能直接引起各种毒力因子进入宿主细胞。铜绿假单胞菌能引起大量的急性和慢性机会性感染。它最强大的武器之一是Ⅲ型分泌系统（TTSS），它直接将强大的毒素注入宿主细胞[23]。TTSS的结构类似于一个针管，它在细菌与宿主细胞浆之间形成了一条复杂的管道以便各种毒素的通过[24]。铜绿假单胞菌是一个拥有TTSS的重要人体致病菌，它依赖于TTSS激活NLRC4炎症小体，铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白也是通过TTSS系统进入宿主细胞激活NLRC4炎症小体。然而没有鞭毛的铜绿假单胞菌也能激活炎症小体，它是通过菌体上的菌毛蛋白激活炎症小体，这种菌毛蛋白的主要成分是Ⅳ菌毛，而Ⅳ型菌毛的主要组成成分是PilA蛋白，也就是说PilA蛋白能激活炎症小体，导致成熟IL-1β的分泌来引起炎性反应。铜绿假单胞菌菌株PA103ΔUΔT虽然拥有完整的TTSS系统，但是不会转运任何的毒素，这种缺乏鞭毛的菌株通过宿主NLRC4蛋白来激活炎症小体[6]。
3.3 炎症小体的作用
炎症小体通常通过一个接頭蛋白ASC（Apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain）使一个传感蛋白和非活化的caspase-1酶原结合在一起。传感蛋白属于一类包含一个核苷酸结合域及亮氨酸重复序列的家族[25-26]。不同的炎症小体的区别是其中所含的NLR（Nod-like receptor）蛋白不同，而且能引起它们反应的刺激物不同。已发现NLR家族蛋白在人和小鼠中超过20种[6]，4种主要炎症小体原型为：NLRP1（NALP1）、NLRP3（NALP3或cryporin）、NLRC4（IPAF、CARD12或CLAN）和AIM2。它们使用不同的配体识别位点结合其它分子。大多数NLRs在胞内感知病原相关分子模式（phogen-associated molecular patterns，PAMP）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）。NALP1能被B.anthracis致死毒素激活；NLRP3炎症小体可由ATP、尿酸晶体和成孔细菌毒素激活；NLRC4炎症小体可由细胞内微生物产物激活[16]。研究最明确的能够激活NLRC4通路的是细菌鞭毛的主要组成蛋白——鞭毛蛋白[6]。研究发现敲除编码PilA蛋白基因的铜绿假单胞菌株PA103ΔUΔT和野生型PA103ΔUΔT分别侵染小鼠巨噬细胞后，与野生型PA103ΔUΔT组相比，敲除PilA蛋白基因的PA103 ΔUΔT组没有IL-1β的分泌，但是细胞毒素乳酸脱氢酶（LDH）和IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）变化不是很大[6]。最终得出缺失PilA蛋白基因的铜绿假单胞菌株PA103ΔUΔT侵染小鼠巨噬细胞时可以减少对炎症小体的激活。
在以前的研究工作中，用体外实验证明了PilA蛋白C端氨基酸残基的改变能够决定铜绿假单胞菌的另一蛋白酶的激活作用，也说明了蛋白分子C端氨基酸残基的变化会影响到蛋白质的主要功能[6]。PilA蛋白D区的KSTQD模体也是位于蛋白的C端部分，结合PilA蛋白可能通过KSTQD模体与DYNLL1相互作用的事实，推测该模体在激活NLRC4通路中很可能起到重要作用。由于DYNLL1是动力蛋白的重要组分，其在细胞中的含量很丰富，那么DYNLL1很可能在PilA蛋白激活NLRC4产生IL-1β的过程中作为一种介质起作用。
铜绿假单胞菌成功侵染人体之后，菌毛蛋白PilA能诱导巨噬细胞产生能1L-1β。1L-1β是寄主防御的关键炎性细胞因子，能够介导多种效应，包括T细胞极化、抗体产生、发热及内皮和吞噬细胞的激活，从而引起炎性反应。目前研究确认PilA蛋白能诱导巨噬细胞产生1L-1β，但是在PilA蛋白中具体起作用的关键氨基酸残基还是不清楚，需要进一步的研究。
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（收稿日期：2017-12-27 本文編辑：苏 畅）
