甘蔗赤腐病菌拮抗细菌twc2的分离鉴定及其防效研究-分手的五十九天 长篇,主赤黑,甜,HE

梁艳琼 唐文 吴伟怀 李乐 习金根 郑肖兰 李锐 郑金龙 黄兴 贺春萍 易克贤

摘 要 由镰孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum Went）引起的赤腐病是甘蔗生产上的主要病害之一，发病时可导致甘蔗产量严重损失。为探求赤腐病有效的生防措施，从热带牧草台湾草叶片上分离到一株生防菌TWC2。经形态观察、16S rDNA序列分析和生理生化鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。平板对峙试验结果发现，TWC2菌株对甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、香蕉黑星病菌（Macrophoma musae）、橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱花草炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、甘蔗环斑病菌（Leptosphaeria sacchari）、王草茎点霉叶斑病菌（Phoma herbarum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等病原菌均具有一定的抑制作用。离体叶片接种试验发现，TWC2菌株对甘蔗赤腐病菌的抑制率达72.01%，盆栽试验与离体叶片接种结果一致，表明TWC2菌株对甘蔗赤腐病具有较好的防治效果。该结论为开发甘蔗赤腐病生防方法打下了基础。

关键词 甘蔗赤腐病 ；解淀粉芽孢杆菌 ；鉴定 ；生防效果

中图分类号 S476.1 ；S435.661 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.013

Abstract Sugarcane red rot is caused by Colletotrichum falcatum Went， and is one of the most devastating diseases of sugarcane， causing serious yield loss. An antagonistic bacterial strain TWC2 was isolated from the leaves of Taiwan grass （Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）， a tropical grass， and used to control the red rot disease. The strain TWC2 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through morphological observation， 16S rDNA sequence analysis， and physiological and biochemical identification. The plate confrontation test showed that the TWC2 had a strong antagonistic activity against the growth of some pathogenic fungi such as Colletotrichum falcatum， Macrophoma musae， Colletotrichum gloeosporioides infecting Hevea brasilliensis， stylosanthes and mango， Leptosphaeria sacchari， Phoma herbarum and Fusarium oxysporum. In vitro leaf inoculation test showed that the TWC2 had an inhibition rate of 72.01% against C. falcatum， which was the same as the pot experiment. This conclusion indicated that TWC2 had a better control effect against the sugarcane red rot. The study laid a foundation for developing an effective biocontrol method to control the sugarcane red rot.

Keywords sugarcane red rot ； Bacillus amyloliquefaciens ； identification ； biological control

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是一種重要的糖料作物和可再生能源作物，盛产于热带和亚热带地区。我国现已成为继巴西、印度之后的世界第三大种植国[1-2]。甘蔗易受各种生物和非生物因素影响，但由镰孢炭疽菌Colletotrichum falcatum Went引起的赤腐病（Red Rot）是甘蔗生产过程中的毁灭性病害，从苗期到成株到收获后均可发生，主要为害蔗茎和叶片中脉，侵害叶鞘和宿根蔗头[3]。该病害不仅导致产量降低，其病原菌还可促使蔗糖转化，降低蔗汁纯度、减少蔗糖糖分[4-5]。抗病育种一直以来被认为是防治甘蔗赤腐病最安全有效的手段，然抗病品种培育时间长，易因病原菌小种变异而丧失抗性[6-7]；化学杀菌剂是当前最有效的甘蔗赤腐病防治方法，但长期使用易使病原菌产生抗性而导致防效下降，且频繁、高浓度的化学杀菌易产生农药残留，造成环境污染，严重威胁人类的健康[8]。随着人们健康、环保意识的增强，生物防治以无毒、无害、无污染、高效等优点而备受关注。因此，研究新的无公害生物防治技术成为解决甘蔗赤腐病的当务之急。

关于甘蔗赤腐病的生物防治，国外已有大量的研究报道。如Viswanathan等[9-10]从甘蔗根际土壤分离到产几丁质的荧光假单胞菌株CHAO、KKMI，并研究其对甘蔗赤腐病菌的防治效果；Singh等[11]从76份印度北方邦、比哈尔邦甘蔗的根际土壤中分离到哈茨木霉（Tichoderma harzianum）、绿色木莓（Tichoderma viride），均对甘蔗赤腐病菌具有抑菌作用，其中哈茨木霉比绿色木霉的抑菌效果更佳；Vijai等[12-13]发现，哈茨木霉（T. harzianum）和绿色木莓（T. viride）的复合培养物、孢子悬浮液和代谢产物对降低甘蔗赤腐病的发病率，提高甘蔗的分蘖率、产量以及蔗种萌发率具有显著效果；Hassan等[14]报道3株枯草芽孢杆菌通过产生脂肽抗生素、水解酶、铁载体等次级代谢产物抑制甘蔗赤腐病菌；Goswami等[15]报道铜绿假单胞菌RL-DS9（rhamnolipid biosurfactant）产生的生物表面活性剂鼠李糖脂能有效抑制甘蔗赤腐病菌。可见，利用生防菌控制植物病害是一种环境友好型的防治措施。为此，本研究从热带牧草——台湾草植株叶片上筛选获得一株对甘蔗赤腐病具有较强拮抗效果的菌株TWC2，并结合形态学、生理生化及分子生物学方法对其进行鉴定，利用离体接种和盆栽接种的方法探究对甘蔗赤腐病菌的抑制效果。以期为甘蔗赤腐病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌

甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum Went）、香蕉黑星病菌[Macrophoma musae （cooke） Berl.et Vogal.]、橡胶树炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、柱花草炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、芒果炭疽病菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Penz. and Sacc.]、甘蔗环斑病菌[Leptosphaeria sacchari V. Breda. de Haan]、王草茎点霉叶斑病菌（Phoma herbarum Wested）和西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum），由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定、保存。

1.1.2 供试培养基

细菌分离纯化采用LB培养基（蛋白胨 10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g，pH 7.0）；菌株筛选及抑菌谱测定选用PDA培养基（去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉15 g，pH 7.0）。

1.1.3 植物材料

甘蔗品种为‘桂糖21号，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗细菌的分离

选取健康的台湾草叶片，用无菌水冲洗干净，在无菌超净工作台上分别剪取直径约5 mm的叶片组织，用75%酒精+0.1%升汞混合液表面消毒30 s，无菌水清洗3次，移植到PDA平板培养基上，28℃培养一定时间后挑取菌落形态不同的菌株，进一步划线纯化保存备用。按五点接菌法将具强致病力的甘蔗赤腐病菌接入PDA培养基平板中央，分离物接于病原菌四周，以不接分离物为对照，倒置培养，从中筛选抑菌作用较强的菌株。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 形态特征和生理生化特征鉴定

菌株的形态特征及生理生化特征测定参照《伯杰细菌鉴定手册》[16]和《常见细菌系统鉴定手册》[17]进行。

1.2.2.2 16S rDNA序列分析

依据细菌DNA提取试剂盒（OMEGA）步骤提取TWC2菌株的DNA，采用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′和引物gyrB：UP-1-Rev1 （5′-CAYGCNGGNGGNAARTTYG-3′），UP-2r （5′-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）进行 PCR 扩增[18]。反应体系为25 μL，包括10 × PCR 缓冲液（ 含Mg2+ ） 2.5 μL， dNTPs（10 mmol/L） 2 μL，引物对27F/1492R各1 μL （ 10 μmol/L），Taq DNA 聚合酶（ 5 U/μL） 0.2 μL，模板DNA 1 μL，最后ddH2O补足至25 μL，以清水为对照。扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃再次延伸10 min，4℃保存。PCR反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，与pEASY-T1克隆载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经阳性克隆检测，挑取有外源片段的质粒于上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 TWC2菌株抑菌谱测定

采用平板对峙法，将7株供试病原菌接入PDA培养基，28℃培养5 d，待菌丝长满培养皿，用打孔器取直径5 mm的菌块置于PDA平板中央，四周接种TWC2菌株，以没有接种TWC2菌株为对照，每处理重复 3 次，按以下公式计算病菌抑制率。

病菌抑制率（%）=（对照菌落半径-处理菌落半径）/对照菌落半径×100%。

1.2.4 TWC2在甘蔗植株及离体叶片的生防效果

将甘蔗赤腐病菌转接在PDA平板上，28℃培养3 d，备用。TWC2接入LB液体培养基，34℃，200 r/min培养24 h，备用。取嫩绿甘蔗叶片，每处理8片叶片，每片用针刺法刺伤3处，随后处理如下：① 将TWC2菌液先喷洒在甘蔗叶脉，待风干后马上接病原菌于针刺处（T+S）；②先接病原菌于针刺处，后喷洒TWC2菌液（S+T）；③只接病原菌于针刺处（S）；④空白，只喷清水于叶片表面（CK）。3 d后观察结果，按十字交叉法测病斑直径并求出面积，按以下公式计算病斑抑制率。

病斑抑制率（%）=（对照病斑总面积-处理病斑总面积）/对照病斑总面积×100%。

2 结果与分析

2.1 TWC2菌株的获取

台湾草叶片组织在PDA培养基培养后，经分离纯化，挑取单菌落，获得形态、大小、颜色一致的纯化菌株31株，备用。用平板对峙法测定上述 31株细菌的抑菌活性，最终得到一株对甘蔗赤腐病菌具有较强抑制作用的菌株，抑菌率达70%以上（圖1），将该菌株命名为TWC2。

2.2 TWC2菌株的鉴定

2.2.1 形态学和生理生化指标

在LB培养基上菌落呈白色，近圆形，表面湿润，有褶皱，不透明；经显微镜观察，菌株呈杆状，具芽孢，革兰氏反应阳性（图2）；具体生理生化指标见表1 。

2.2.2 16S rDNA 序列与同源性分析

以TWC2的基因组DNA为模板，进行 PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，检测到一条大小约1 500 bp的条带（图3-A），测序结果为1511 bp。将测序结果在 NCBI GenBank上进行序列比对，发现与Bacillus amyloliquefaciens JN382250、KU363819和NR116022同源性最高，达99%。利用MEGA6软件进行聚类分析，构建系统进化树（图4），TWC2菌株和解淀粉芽孢杆菌聚在同一分支上，初步认定TWC2菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.2.3 gyrB基因序列分析

进一步用细菌分类中常用的gyrB基因对TWC2进行分析，以TWC2基因组DNA为模板，扩增gyrB基因，电泳检测目的片段（图3-B）与预计片段大小基本吻合。搜索GenBank 数据库里相关芽胞杆菌gyrB基因序列，以荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）为外群，采用MEGA 6软件中的Neighbor-Joining 法构建系统进化树（图5），结果显示，Bacillus thuringiensis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Brevibacillus brevis聚在一个大分支里，Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens聚在另一个分支上，TWC2与Bacillus amyloliquefaciens的GM-1、FQS38、DY1b菌株聚在同一分支，亲缘性最近，这与16S rRNA 基因系统发育分析结果一致。

综合菌落形态、生理生化特性、16S rDNA 序列分析、gyrB 基因系统发育分析，最终将TWC2鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

2.3 对其他病原真菌的抑制作用

为研究拮抗菌株TWC2 的生防潜力，采用平板对峙法对其抑菌谱进行测定。结果表明，菌株TWC2对7株供试病原真菌均有较高的拮抗活性（图6），其中对甘蔗赤腐病菌、柱花草炭疽病菌、芒果炭疽病菌的抑制率最高，均达70%以上（表2）。

2.4 TWC2对甘蔗赤腐病的防治效果

如图7所示，对照组叶片叶脉状况良好，没有出现病斑。由表3可知，T+S处理组叶片叶脉出现病斑，但面积较小，仅为9.11 mm2；S+T处理组叶片病斑面积较大，为14.44 mm2；S处理组叶片受赤腐病菌侵染较为严重，病斑面积达32.56 mm2。说明T+S处理组、S+T处理组对赤腐病菌均有一定抑制作用，其中T+S处理组抑制率最高，达72.01%，S+T处理组其次，为55.63%，而未喷洒TWC2菌液的S处理组和空白处理抑制率为0。盆栽试验（表4）与离体叶片接种结果（表3）基本一致， 说明TWC2菌株对甘蔗赤腐病具有较好的防治效果。

3 讨论

赤腐病是甘蔗生产过程中的常见病害，广泛分布于世界各蔗区，苗期至成株期均可发病，严重时可导致30%左右的减产[13]。目前，防治该病的主要措施是抗病育种和化学防治，但均存在较多缺陷；生物防治以其无污染、持效期久、环境兼容性好等特点被认为是最具有发展潜力的防治方法之一。开展甘蔗赤腐病生物防治最基础的工作之一就是筛选具有不同生物学特性的生防微生物，国外研究人员已经分离获得了一些对甘蔗赤腐病菌具较好效果的生防微生物。Suresh等[19]研究了哈茨木霉、绿色木霉、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉和硫曲霉等6种根际土壤真菌对甘蔗赤腐病菌的拮抗活性。Hassan等[20]发现，大田条件下恶臭假单胞菌菌株NH-50可使甘蔗赤腐病减轻44%～60%的危害程度，该菌分泌的胞外代谢物和挥发性物质对甘蔗赤腐病菌同样具有抑制作用。Mehnaz等[21]从甘蔗植株茎杆、根部及根际土壤分离获得对甘蔗植株的生长具有影响作用的7株假单胞菌，并探究了它们的产抗真菌化合物HCN情况和对甘蔗赤腐病的生防效果。

总的来说，目前对甘蔗赤腐病菌有抑制作用的生防菌中，以假单胞菌（Pseudomonas spp.）和木霉（Trichoderma spp.）居多。本研究从台湾草叶片上分离获得一株解淀粉芽孢杆菌，室内防效试验结果表明，该菌株对甘蔗赤腐病菌具有较高的抑制活性，对赤腐病菌抑制率达72.01%，为甘蔗赤腐病的防治提供了新的生防资源。

解淀粉芽孢杆菌是目前一种重要的芽孢杆菌类生防菌，其在生长过程中会分泌某些物质和代谢产物，这些物质对很多真菌和细菌均具有抑制作用。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌对白粉菌（Erysiphe）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、大麗轮枝菌（Verticillium dahliae）、梨孢霉菌（Piricularia sp.）、雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、禾谷多粘菌（Polymyxa graminis）、青霉菌（Penicillium sp.）、稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola， Xooc）、丝核菌（Rhizoctonia solani）、镰刀菌（Fusarium oxysporum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、链格孢（Alternaria Nees）等多种病原菌都具有很好的拮抗作用[19-27]。本研究结果表明TWC2不仅能抑制甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱花草炭疽病菌（C.gloeosporioides）和芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等病原真菌的生长，而且对香蕉黑星病菌（Macrophoma musae）、甘蔗环斑病菌（Leptosphaeria sacchari）、王草茎点霉叶斑病菌（Phoma herbarum Wested）和西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）也有较好的抑制作用。说明解淀粉芽孢杆菌TWC2是一株具有广谱抑菌活性的拮抗菌。此外，解淀粉芽胞杆菌的防效具有较好的稳定性，张荣胜[28]等人研究发现，解淀粉芽孢杆菌Lx-11对水稻细菌性条斑病的盆栽防效达 62.5%，大面积示范试验的防效则为 60.2%，显著高于20%叶枯唑的防效（51.2%和 45.8%）。杨洪凤[29]盆栽试验表明，内生解淀粉芽孢杆菌 CC09的菌株发酵液对小麦白粉病有很高的预防治疗效果，15 d防效为 95%，为三唑酮的2.3倍。本研究中，离体叶片和盆栽试验均表明，菌株TWC2对甘蔗赤腐病有较好的防效，该结果进一步验证了芽孢杆菌防效的稳定性。

综上所述，解淀粉芽孢杆菌TWC2抗菌谱广，为甘蔗赤腐病害中开发应用潜力较大的生防菌。当然，要实现在生产上的推广应用，仍需在生产、代谢产物的纯化與鉴定以及生防机制等方面做进一步的研究。未来随着发酵条件与应用方式的进一步优化，该菌生防潜力将会得到进一步提升。

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