盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠早期肝脏血管内皮细胞和肝损伤变化及其相关...
郭海雷 卢才教 刘政军 凌翔伟 胡德林 方林森
[摘要] 目的 觀察早期脓毒症大鼠模型心脏冠状动脉内皮与心肌细胞损害情况，探讨内皮细胞在心肌损害中发挥的作用。 方法 SD大鼠72只，随机分为正常、假手术和脓毒症组，采用盲肠结扎加穿孔术（CLP）制备脓毒症模型，术后3 h、6 h、12 h和24 h测量心肌力学指标，包括左室收缩峰压（LVSP）、左室压力最大上升速率（+dp/dt max）和左室压力最大下降速率（-dp/dt max），并测量血清内皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、肌钙蛋白I（cTnI）水平，透射电镜观察冠状动脉内皮细胞和心肌细胞超微结构变化。 结果 脓毒症组NO和ET-1水平在术后即明显升高，12 h达峰值；NO和ET-1比值在CLP术后3 h即开始明显降低，持续低于正常水平。冠状血管内皮细胞超微结构损伤呈逐步加重，管腔内脱落内皮细胞数目增多，内皮细胞超微结构损伤评分逐步增高。CLP后3 h即出现收缩舒张功能显著下降，LVSP、±dp/dt max术后6 h达最低；脓毒症组血清cTnI在术后即明显升高，12 h时点达峰值；脓毒症组心肌细胞超微结构显示肌原纤维、肌浆网、线粒体等损伤逐渐加重，但线粒体数目有增多现象。 结论 脓毒症早期即存在明显冠状动脉内皮损伤，心肌细胞损害和心肌功能障碍，内皮细胞在心肌损害中可能扮演重要角色。
[关键词] 脓毒症；内皮细胞；心肌细胞；肌钙蛋白I；内皮素
[中图分类号] R656.7；R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）10-0037-05
Study on the early vascular endothelial and myocardial damage in rats with sepsis and its correlation
GUO Hailei1 LU Caijiao1 LIU Zhengjun1 LING Xiangwei1 HU Delin2 FANG Linsen2
1.Burn and Wound Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China； 2.Department of Burn Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China
[Abstract] Objective To observe the damages of coronary artery endothelium and myocardial damage in the rat model of early sepsis and to explore the role of endothelial cells in myocardial damage. Methods 72 SD rats were randomly divided into normal， sham-operation and sepsis groups. Cecal ligation and perforation（CLP） was used to prepare sepsis model. 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after surgery， indices of myocardial mechanics were measured， including left ventricular systolic pressure （LVSP）， maximum increasing rate of left ventricular pressure （+dp/dt max） and maximum decreasing rate of left ventricular pressure（-dp/dt max）. The levels of endothelin 1 （ET-1）， nitric oxide（NO）， troponin I （cTnI） were measured. TEM was used to observe endothelial cells of coronary artery and myocardial ultrastructure changes. Results The levels of NO and ET-1 in sepsis group were increased significantly after operation and peaked at 12 hours； the ratio of NO to ET-1 was decreased significantly at 3 h after CLP， and remained below normal level. Coronary endothelial cell ultrastructure damage was gradually increased， exfoliative endoluminal endothelial cells were increased， and endothelial cell ultrastructure damage score was gradually increased. 3 h after CLP， the systolic and diastolic function was decreased significantly. LVSP， ±dp/dt max reached the lowest at 6 h after operation； serum cTnI in sepsis group was increased significantly after operation and peaked at 12 h. The ultrastructure of myocardial cells in sepsis group showed that the myofibrils， sarcoplasmic reticulum， mitochondria and other damages were gradually aggravated， but there was an increase in the number of mitochondria. Conclusion In the early stage of sepsis， there are obvious coronary endothelial damage， myocardial cell damage and myocardial dysfunction. Endothelial cells may play an important role in myocardial damage.
[Key words] Sepsis； Endothelial cells； Myocardial cells； Troponin I； Endothelin
脓毒症是指因感染引起机体反应失调而引起致命性多脏器功能障碍，存在循环、细胞和代谢功能异常[1]。脓毒症和脓毒性休克目前仍是引起死亡的重要原因，每年全球脓毒症患者数量超过数百万，约1/4甚至更多患者因此死亡[2]。目前脓毒症的病理生理学机制尚未完全明确，其中内皮细胞作为炎症反应的重要靶细胞和效应细胞，其凋亡、脱落、通透性改变，失控性分泌多种细胞因子和炎性物质，引起凝血功能紊乱等在脓毒症进展中发挥重要作用[3，4]。脓毒症心功能障碍表现为心肌收缩、舒张功能下降，是一种“功能性”、可逆性改变，是严重脓毒症的常见并发症，合并心功能障碍患者病死率可达70%～90%，被认为是脓毒性休克患者病死率的独立危险因素[5]。本实验采用经典的CLP脓毒症大鼠模型，通过检测血清NO、ET-1和cTnI水平，测定心肌力学、透射电镜下观察冠状动脉内皮和心肌细胞细胞核、线粒体、肌原纤维等超微结构变化，深入了解脓毒症大鼠早期血管内皮、心肌细胞损害和心肌功能障碍情况，探讨内皮细胞可能在脓毒症心肌损害中扮演的角色。
1 材料与方法
1.1 动物分组与脓毒症模型制备
SD大鼠72只，清洁级，♂♀各半，体重（250±30）g（购于安徽醫科大学动物中心）。SD大鼠染色编号后随机分正常组（N组）、假手术组（S组）和脓毒症组（C组），S组和C组又分为手术后3 h、6 h、12 h和24 h四个亚组（S1，S2，S3，S4，C1，C2，C3，C4），每组8只SD大鼠，动物分笼饲养。
使用CLP法复制脓毒症模型：SD大鼠皮下注射水合氯醛（浓度10%，0.03 mL/kg），麻醉显效后固定，腹正中线切开约1.5 cm，拉出盲肠，根部丝线结扎，用18号注射针头贯穿盲肠3次，挤压盲肠见有粪便流出，回纳盲肠后逐层关腹。术后立即在大鼠皮下注射NS 5 mL预防休克。S组大鼠仅行盲肠探查术。
1.2 心肌力学测量
N组在3 h时点，S组和C组在3 h、6 h、12 h和24 h四时点分批用水合氯醛（浓度10%，0.03 mL/kg）麻醉大鼠，固定，颈部去毛后切开皮肤，找到、分离左颈内动脉，将导管置入左心室内，采用生物机能实验系统（BIOPAC-11A2055型）测量3 h、6 h、12 h和24 h时点的LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max，稳定2 min后记录数值。心肌力学测定后开腹，从腹主动脉留取血标本待检测。动物失血死亡后立即开胸取出心脏，切取部分心肌和冠状动脉置于戊二醛液（浓度2.5%）中固定。
1.3 冠状动脉内皮细胞和心肌细胞电镜下观察
戊二醛溶液固定后的冠状动脉和心肌组织经包埋、切片后在JEM-1230型透射电镜下观察超微结构。
1.4 血管内皮细胞超微结构损伤评分
根据大鼠冠状动脉血管内皮细胞在透射电镜下超微结构改变，按照有关文献[6]稍作改变后对血管内皮细胞损伤程度进行评分，评分标准见表1。
1.5 cTnI、NO和ET-1测定
留取的血标本4000转/min离心10 min，分离血清放置-80℃冰箱保存。使用酶联免疫法检测血清cTnI、ET-1水平，硝酸还原法检测血清NO水平。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清NO、ET-1和内皮细胞超微结构损伤评分的变化
与S组和N组比较，C组血清NO、ET-1术后3 h即持续升高（P<0.01），24 h时点较前略有回落，但仍维持较高水平；NO和ET-1比值CLP术后3 h即开始逐步下降，显著低于N组和S组（P<0.05）；C组大鼠CLP术后3 h冠状动脉血管内皮细胞超微结构损伤评分即开始升高，分值逐步增大。见表2。
2.2 心肌力学和血清cTnI变化
与S组和N组比较，C组心肌力学指标（LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max）术后3 h即明显降低，在6 h达谷底，12 h后有所回升，但仍显著低于对照组（P<0.05）；C组术后3 h血清cTnI水平持续升高，显著高于同时点S组与N组（P<0.01），24 h时点有回落趋势，但仍显著高于正常水平。见表3。
2.3 冠状动脉内皮细胞和心肌细胞电镜下变化
CLP术后3 h 大鼠冠状动脉血管内皮细胞表现为水肿，轮廓变圆，线粒体也呈现肿胀；CLP术后12 h冠状动脉血管内皮细胞部分可见核皱缩和染色体边集，胞内溶酶体数目增加，部分线粒体脊突结构破坏消失，可见部分内皮细胞与血管基膜分离；CLP术后24 h可见较多轮廓不清的冠状动脉血管内皮细胞，胞内较多线粒体脊突结构消失，出现核固缩和空泡样改变，冠状动脉管腔内可见数目较多的凋亡脱落的内皮细胞（图1～4）。
CLP术后3 h SD大鼠心肌肌原纤维间距离开始逐渐增宽、溶解，肌浆网扩张，线粒体肿胀，随脓毒症进展损伤逐步加重，CLP术后24 h心肌肌原纤维结构破坏严重，大量肌原纤维断裂、溶解，并见部分线粒体结构模糊，但数目有增多表现（图5～8）。
3 讨论
目前脓毒症发病机制尚不完全明确，认为失控性炎症反应、凝血功能障碍和微血管功能紊乱在脓毒症病理生理变化中担当关键角色，其中内皮细胞的激活和损伤在脓毒症发展过程中发挥重要作用[7-9]，是SIRS、MODS、MOF发生发展过程中的关键环节之一。关于脓毒症心功能障碍的病理生理学机制尚不明确，目前研究认为心肌抑制因子、氧化应激、线粒体功能损害、神经内分泌调节障碍、能量异常代谢等方面可能参与脓毒症心功能障碍的病理生理过程，心肌损害是脓毒性休克患者病死率的独立危险因素，可影响脓毒症患者预后[5]。
内皮细胞作为炎症反应的重要靶细胞因钙超载损伤而发生凋亡和坏死，内皮细胞与基膜分离、脱落，血管通透性增加，炎性细胞游走到脏器组织，促使组织炎症反应加重；内皮细胞作为效应细胞分泌多种细胞因子和炎性介质，造成组织器官损伤加重，加速脓毒症的进程[10-12]。ET-1和NO主要由内皮细胞产生的血管收缩和舒张调节物质，二者分泌失调时可造成严重的机体组织缺血缺氧性损伤[13，14]。生理状态下的NO具有抑制白细胞与血管内皮粘附、抑制血小板凝集、调节内皮素的分泌水平、防止血管收缩痉挛及血栓形成、维持心脏等重要器官的血液灌注等作用[15]。脓毒症及脓毒症休克时，机体在炎症介质、内毒素等刺激下高表达iNOS，产生大量NO，启动机体内的硝化应激反应，对细胞产生毒性作用，造成肺组织等损伤[15，16]。ET-1对血管平滑肌具有强烈持久的收缩作用，能使机体各种血管发生收缩，尤其是心脏冠状动脉，其主要表达于内皮细胞。本研究中SD大鼠CLP术后3 h血清NO和ET-1即明显升高，12 h达到最大值，分别为（123.5±4.2）μg/mL、（148.4±9.7）pg/mL，24 h稍有降低，但仍明显高于假手术组和正常组（P<0.01），而NO和ET-1比值呈下降趋势，每时点比值均显著低于正常组（P<0.05）。实验结果提示，内皮细胞在脓毒症状态下过度产生NO，高表达内皮素，且二者比例失衡，在脓毒症的发生发展过程中可能起到重要作用，尤其在心肌毒性、心肌缺血缺氧性损伤中可能起关键作用；如果能够有效防治NO和ET-1的过度表达与释放，将二者调控在合适比例，势必可能会减轻脓毒症脏器损害。凋亡的内皮细胞脱落后形成循环内皮细胞，其数量可以直接和特异地反映活体内血管损伤情况[17]。本实验电镜下观察冠状动脉血管内皮细胞超微结构损伤评分呈逐步升高，内皮细胞呈现水肿，线粒体棘突消失、肿胀，核固缩、空泡样变化，并逐步加重，最后较多内皮细胞凋亡脱落至管腔内。内皮细胞凋亡、脱落，引起凝血功能紊乱，微循环障碍，累及多系统和脏器，进而导致MODS发生，所以内皮细胞可能是寻找脓毒症治疗的重要靶细胞。
cTnI是较CK、CK-MB敏感性和特异性更高的心肌细胞损伤标志物，cTnI升高水平与脓毒症的严重程度有关，持续性升高预示心功能障碍和不良预后[18]。Cheng H等[19]通过对430例患者的研究认为cTnI是严重脓毒症及感染性休克患者强有力的预测病死率的指标。本实验显示脓毒症大鼠早期就出现cTnI增高，持续高于正常水平，提示脓毒症初期即存在明显的心肌细胞结构破坏，实验中透射电镜观察也证实脓毒症早期心肌细胞超微结构破坏明显，表现为肌原纤维间距变宽，溶解破坏逐步加重，线粒体出现肿胀、棘突消失，结构模糊等，故而脓毒症早期采取有效措施减轻心肌细胞损害尤为重要。本实验中cTnI水平在CLP术后C3达峰值[（1.489±0.260）ng/mL]，之后有所降低，与持续损害的心肌细胞超微结构有差异，cTnI非持续性升高可能与cTnI释放、降解动态平衡及耗竭有关[20]。LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max是反映心肌收缩、舒张功能的敏感指标。本实验显示LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max在CLP术后3 h即呈现显著下降，6 h时达到谷底，在12 h后有回升表现，提示脓毒症初期即存在心肌收缩、舒张功能异常，其可能是“可逆性”功能改变，所以临床上早期进行心肌保护治疗可能对脓毒症患者预后有益[5]。电镜观察脓毒症时心肌超微结构损害呈逐步加重，而心肌力学并非持续降低，其机制尚不明确，可能与神经内分泌负反馈调节、心肌抑制因子衰減、消耗、心肌线粒体诱生等因素有关[20]。
有研究显示一些抗炎药物，如乌司他丁、血必净等在减轻内皮细胞活化、损害的同时可显著改善心肌功能，减少心肌细胞损害[21，22]。本实验结果显示，脓毒症早期血清NO、ET-1水平明显升高，且比例失调的同时，cTnI水平显著升高，心肌功能下降，透射电镜下观察到脓毒症早期冠状动脉血管内皮细胞损伤的同时伴有心肌细胞损伤，二者超微结构损害均呈进行性加重，提示脓毒症状态下血管内皮细胞和心肌细胞损伤可能相关，内皮细胞可能通过多途径参与心肌损害，如血管内皮细胞在毒素和失控性炎性细胞因子刺激下诱导NO和ET-1大量表达和释放，高浓度的NO可对心肌细胞直接产生毒性作用，且二者比例失衡可引起血管痉挛收缩，引起缺血缺氧性心肌损害；凋亡的血管内皮细胞从基底膜脱落，造成胶原暴露，启动内源性凝血机制，引起凝血功能紊乱、血小板聚集、血栓形成，加重心肌微循环障碍；脓毒症状态下内皮细胞损伤和活化，其表面过量表达的黏附分子、选择素（如VCAM-1、E-选择素等）诱导白细胞的趋化、黏附和游走，游走至心肌组织的白细胞释放过量髓过氧化物酶、蛋白水解酶、炎性介质等有害物质可对心肌细胞造成直接损害。
综上，脓毒症早期即出现显著心肌和血管内皮细胞损害，内皮细胞在心肌损害中可能扮演重要角色，其具体机制有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2017-10-08）
