枳椇子乙醇提取物对猪油抗氧化能力研究.pdf

王斌利 张莉霞 石晓峰 李运 王新娣 邱国玉 沈薇 李志俊

摘要：目的 评价紫斑牡丹花粉的不同浓度乙醇提取物的抗氧化能力。方法 通过测定紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的3种抗氧化能力（铜离子还原能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力），对紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的抗氧化性能进行评价。结果 铜离子还原能力法测得紫斑牡丹花粉无水乙醇提取物、75%乙醇提取物、50%乙醇提取物、25%乙醇提取物和水提取物的抗氧化活性没食子酸量依次为26.00、28.33、28.90、14.98、9.24 mg/g；紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的清除DPPH自由基和ABTS自由基能力均低于维生素C，其顺序依次为：50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>无水乙醇提物>25%乙醇提取物>水提取物。结论 紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物均具有较强的抗氧化能力，以50%、75%乙醇提物的抗氧化能力最强。

關键词：紫斑牡丹花粉；不同浓度乙醇提取物；抗氧化性能；铜离子还原能力法；DPPH自由基清除法；ABTS自由基清除法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0065-04

Study on Antioxidant Activity of Different Concentrations of

Alcohol Extracts from Paeonia Rockii Pollen

WANG Bin-li1，2， ZHANG Li-xia2， SHI Xiao-feng1，2， LI Yun3， WANG Xin-di1， QIU Guo-yu3， SHEN Wei1， LI Zhi-jun3

1. Gansu Academy of Medical Science， Lanzhou 730050， China； 2. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730030， China

Abstract： Objective To evaluate the antioxidant activity of different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen. Methods The antioxidant activity of different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen was evaluated by cupric reducing power method， DPPH radical scavenging activity method and ABTS radical scavenging activity method. Results The amounts of antioxidant activity of gallic acid of anhydrous ethanol extract， 75% alcohol extract， 50% alcohol extract， 25% alcohol extract， and water extract from Paeonia Rockii pollen were 26.00， 28.33， 28.90， 14.98， and 9.24 mg/g， respectively. The sequence of the ability of scavenging DPPH free radical and ABTS radical was Vc > 50% alcohol extract > 75% alcohol extract > anhydrous ethanol extract > 25% alcohol extract > water extract. Conclusion The different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen has relatively strong antioxidant activity， especially for 50% alcohol extract and 75% alcohol extract.

Keywords： Paeonia Rockii pollen； different concentrations of alcohol extracts； antioxidant activity； cupric reducing power method； DPPH radical scavenging activity method； ABTS radical scavenging activity method

紫斑牡丹Paeonia rockii为毛茛科Ranunculaceae芍药属Paeonia L.多年生木本植物，又名甘肃牡丹、西北牡丹，因其花瓣基部有一个明显的色斑而得名[1]，是仅次于中原牡丹品种群的第二大品种群[2]，是我国中西部地区的特有中药材和花中珍品。其分布于四川北部、甘肃南部及陕西秦岭中段以西部分，被列为国家珍稀濒危三级重点保护植物[3]。近10年来，紫斑牡丹在甘肃省陇南、天水、定西、临夏及兰州等地广泛种植，不仅是一种重要的观赏植物，其根皮作为药用牡丹皮被甘肃省中药材标准收载并对其有效成分进行了研究[4-5]。

有研究表明，凤丹牡丹花粉中含有大量可以促进健康、增加机体防御能力的天然活性物质，其黄酮类成分具有很好的抗氧化活性[6-7]，而有关紫斑牡丹花粉的开发研究目前尚未见文献报道。为了进一步对紫斑牡丹进行开发利用，本研究通过测定紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的3种抗氧化能力（铜离子还原能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力），评价紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的抗氧化性能。

1 仪器与试药

UV-240紫外分光光度仪（日本岛津公司），AE260 万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），CP225D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司），KQ2200B超声清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司），HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

2，9-二甲基-1，10菲啰啉（新亚铜灵，批号20160307，含量>98%），国药集团化学试剂有限公司；没食子酸对照品（批号110831-200803，供含量测定用），中国食品药品检定研究院；维生素C（Vc，批号Q/12HB3966-2009，含量>99.8%），天津市科密欧化学试剂有限公司；1，1-二苯代苦味酰基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·），2，2'-连氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（[2，2'-azino-bis（3- ethylbenzothiazoline）-6-sulphonic acid] diamonium salt，ABTS·），美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

紫斑牡丹花粉于2015年5月采自兰州新区中川牡丹园，其原植物经兰州牡丹园艺开发公司赵潜龙高级工程师鉴定为Paeonia rockii（S. G. Haw et L. A. Lauener）T. Hong et J. J. Li。

2 方法与结果

2.1 铜离子还原能力法测定抗氧化活性

2.1.1 檢测试剂的制备

氯化铜溶液：精密称取氯化铜90 mg，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，备用。醋酸铵溶液：精密称取醋酸铵3800 mg，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，备用。新亚铜灵溶液：于暗室精密称取新亚铜灵79 mg，用甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，备用（现配现用，4 ℃避光保存）。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品1.40 mg，用50%甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.014 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品贮备液的制备

精密称取紫斑牡丹花粉5份，每份2.00 g，置于100 mL圆底烧瓶中，分别加入25倍量的不同溶剂（无水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水），称定质量，加热回流提取2 h，取出，放冷，再次称定质量，补足减失的质量，静置，取上清液，置于4 ℃冰箱中，备用。

2.1.4 线性关系考察

分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于1 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，配制成系列浓度的没食子酸对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各1 mL，依次加入氯化铜溶液、新亚铜灵溶液及乙酸铵溶液各1 mL，再加入水1 mL，即得系列浓度的没食子酸对照品反应液；精密吸取50%甲醇1 mL，依次加入氯化铜溶液、新亚铜灵溶液及乙酸铵溶液各1 mL，再加入水1 mL，即得空白反应液。分别将充分混匀后的没食子酸对照品反应液和空白反应溶液于室温下放置反应30 min，以空白反应液为参比，于450 nm波长处测定系列浓度没食子酸对照品反应液的吸光度。以吸光度值为纵坐标，没食子酸质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=38.778X-0.011 4，r2=0.999 2。结果表明，没食子酸质量在7×10-4～14×10-3 mg范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.1.5 样品活性测定

参考文献[8]方法，精密吸取供试品贮备液各0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加不同提取溶剂定容至刻度，得到供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液1 mL，依次加入氯化铜溶液、新亚铜灵溶液及乙酸铵溶液各1 mL，然后再加入1 mL蒸馏水，即得供试品反应液。精密吸取供试品提取对应溶剂1 mL，依次加入氯化铜溶液、新亚铜灵溶液及乙酸铵溶液各1 mL，最后加入1 mL蒸馏水，得到空白反应液。分别将充分混匀后的供试品反应液和空白反应液于室温下放置反应30 min，以空白反应液为参比，于450 nm波长处测定供试品反应液的吸光度，再将测得的吸光度值代入标准曲线求得X，计算供试品的抗氧化活性没食子酸量（X×N×V÷m，N为稀释倍数，V为供试品总体积，m为称样量），结果水提液及25%、50%、75%、100%乙醇提取液中没食子酸含量分别为9.24、14.98、28.90、28.33、26.00 mg/g。

2.2 不同浓度乙醇提取物清除自由基能力测定

2.2.1 溶液的配制

DPPH·溶液：精密称取DPPH· 8 mg，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，即得。

ABTS·溶液：精密称取ABTS· 0.192 2 g，置于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容，即得A液；精密称取过硫酸钾0.067 6 g，置于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容，即得B液。按体积比2∶1将A、B液混匀，避光12 h，备用。临用前用无水乙醇稀释至吸光度为0.6±0.1，得ABTS·工作液。

Vc对照品溶液：精密称取Vc对照品20 mg，置于5 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，即得浓度为4 mg/mL的Vc对照品溶液。

2.2.2 DPPH自由基清除率测定

参考文献[9]方法，将“2.1.3”项下制备的不同浓度乙醇提取液及Vc对照品溶液稀释成0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mg/mL系列浓度溶液。分别精密移取上述供试品溶液及Vc对照品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，各加DPPH·溶液2 mL，再加各供试品和对照品的对应溶剂2 mL，摇匀，室温避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度值（A1），同时以无水乙醇为参比，测定DPPH·空白溶液吸光度值（A0），计算清除率。DPPH自由基清除率（%）=（A0-A1）÷A0×100%。结果见图1。

2.2.3 ABTS自由基清除率测定

将“2.1.3”项下制备的不同溶剂提取液及Vc对照品溶液稀释成8、16、32、48、64、80 μg/mL系列浓度溶液。分别精密移取上述供试品溶液及Vc对照品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，各加ABTS·溶液2 mL，再加各供试品和对照品的对应溶剂2 mL，摇匀，放置10 min后在734 nm波长处测定吸光度值（A1），同时以水为参比测定ABTS·空白溶液吸光度值（A0），计算清除率。ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）÷A0×100%。结果见图2。

3 討论

现有文献报道多通过DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基、羟自由基清除能力和铁离子、铜离子还原能力等来评价样品的抗氧化能力[10-13]。其中，铜离子还原能力法是用于测定多组分混合物的抗氧化活性的，可同时用于评价亲脂性和亲水性抗氧化剂的抗氧化活性，反应不易受光、空气、氧、pH值等因素的影响[14-15]。但不同的测定方法各有利弊，在评价样品体外抗氧化能力时应尽量多地采用适合于样品性质和多种方法进行抗氧化性评价，才能全面反映待测物质的抗氧化活性。为此，本研究采用铜离子还原能力法结合DPPH、ABTS自由基清除法综合评价紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物的抗氧化活性。

本试验结果显示，铜离子还原能力测得紫斑牡丹花粉无水乙醇提取物、75%乙醇提取物、50%乙醇提取物、25%乙醇提取物及水提取物的抗氧化活性没食子酸量依次为26.00、28.33、28.90、14.98、9.24 mg/g；DPPH和ABTS的自由基清除能力所得结果基本一致，紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力均低于Vc，其顺序依次为：50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>无水乙醇提物>25%乙醇提取物>水提取物。由此可见，50%、75%乙醇提取物抗氧化活性最强。

动脉粥样硬化、癌症、神经性疾病等多种疾病都与氧化胁迫有关[16]，许多外源性小分子作为抗氧化剂可以抵抗活性氧造成的危害。紫斑牡丹花粉50%、75%乙醇提取物具有较强的抗氧化活性，可能与其所含黄酮类和多酚类化合物有关[7，17]。我们计划后续研究将其开发成可供利用的天然抗氧化剂，用于疾病预防。

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