...线粒体融合蛋白_基金支持热词逐...-线粒体与阿尔茨海默病

李雅悦 李广诚 朱宏 梁梅亭 萨依腊西

摘要：目的 觀察针刺对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠行为学，大脑海马神经元线粒体分裂蛋白1（Fis1）、线粒体融合蛋白1（OPA1）表达及线粒体超微结构的影响，探讨针刺治疗AD的作用机制。方法 40只雄性SAMP8小鼠随机分为针刺组和模型组，每组20只。另取20只同月龄雄性正常老化模型小鼠（SAMR1小鼠）作为正常组，针刺组选取“肾俞”“百会”“血海”“膈俞”进行干预。8周后，Morris水迷宫实验检测小鼠行为学，之后提取海马组织，Western blot检测小鼠海马线粒体相关蛋白Fis1和OPA1的表达，电镜观察小鼠海马神经元线粒体超微结构。结果 与模型组比较，针刺组逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），其停留在原平台象限时间延长和穿越原平台次数明显增加（P<0.05）；针刺组Fis1表达明显减弱，OPA1表达明显增强（P<0.05，P<0.01）；针刺组线粒体超微结构明显改善，线粒体体密度及面密度明显增加（P<0.05）。结论 针刺可能通过提高模型小鼠学习记忆能力、下调Fis1表达、上调OPA1表达和改善线粒体超微结构，达到治疗AD的作用。

关键词：针刺；阿尔茨海默病；Morris水迷宫；线粒体分裂蛋白1；线粒体融合蛋白1；超微结构；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.014

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0059-06

Effects of Acupuncture on Behaviors， Expressions of Fis1 and OPA1， and Mitochondrial Ultrastructure of Mice Model of Alzheimer Disease

LI Ya-yue， LI Guang-cheng， ZHU Hong， LIANG Mei-ting， Sayilaxi

The Third Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410013， China

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on the behaviors and the expressions of Fis1 and OPA1， as well as mitochondrial ultrastructure in the hippocampus of mice with Alzheimer disease （AD）； To explore the mechanism of action of acupuncture for AD. Methods Forty male SAMP8 mice were randomly divided into acupuncture group and model group， with 20 mice in each group. Another 20 male natural aging mice with the same age （SAMR1 mice） were set as the normal group. Acupuncture group chose Shenshu， Baihui， Xuehai and Geshu for intervention. 8 weeks later， Morris water maze was used to test the mice behaviors， and then hippocampus organization was taken. Western blot was used to detect the expressions of Fis1 and OPA1 and mitochondrial ultrastructure in hippocampal neurons of mice was observed by transmission electron microscopy. Results Compared with the model group， the escape latency of acupuncture group was significantly shortened （P<0.05）， and the stay time in the former platform quadrant and former platform crossing times were significantly increased （P<0.05）. The expression of Fis1 in the hippocampus of acupuncture group decreased significantly （P<0.05）， while the expression of OPA1 increased significantly （P<0.05）. The mitochondrial ultrastructure in hippocampus in the acupuncture group was effectively improved， and the mitochondrial surface density and body density were both increased in the acupuncture group compared with the model group （P<0.05）. Conclusion Acupuncture may play a potential therapeutic role in AD by decreasing the expression of Fis1， increasing the expression of OPA1， recovering the injury of mitochondrial ultrastructure.

Keywords： acupuncture； Alzheimer disease； Morris water maze； Fis1； OPA1； mitochondrial ultrastructure； mice

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性病变，临床表现以近期记忆减退、语言功能障碍、认知功能障碍、自主生活能力下降，人格和行为的改变为主要特征[1]。大量研究表明，线粒体动力学异常（分裂增加、融合减少）及形态结构异常在AD发病早期扮演着重要角色[2-3]，在AD患者和动物模型神经元细胞中均发现线粒体动力学异常的改变。

针刺是AD治疗的一个重要手段，前期研究表明，针刺能够改善AD患者的认知功能[4]，改善AD模型小鼠的学习记忆能力[5]，针刺能上调SAMP8小鼠海马组织脑红蛋白的表达，其治疗作用机制可能涉及激发内源性抗氧化体系，从而发挥抗氧化应激作用[6]，可明显降低SAMP8小鼠脑内乙酰胆碱酯酶活性，改善胆碱能系统的功能[7]。针刺还能上调中性内肽酶（NEP）的表达来促进β-淀粉样蛋白（Aβ）的降解，减少Aβ的沉积，从而发挥神经保护作用[8]。我们还研究了针刺对SAMP8小鼠海马蛋白质组学表达的影响，鉴定出线粒体乌头酸水合酶、细胞色素C氧化酶[9]以及脑红蛋白等多种与氧化应激相关的差异表达蛋白，而线粒体是细胞内氧自由基的主要来源，这说明线粒体可能是针刺发挥治疗作用的主要“亚细胞器靶点”。本研究立足于SAMP8小鼠行为学改变、线粒体动力学异常及超微结构改变在AD发病中的重要作用，以AD模型小鼠为研究对象，采用Morris水迷宫实验检测小鼠行为学，Western blot检测线粒体分裂蛋白1（Fis1）和线粒体融合蛋白1（OPA1）表达，电镜观察AD模型小鼠海马神经元线粒体超微结构，从SAMP8小鼠行为学改变、线粒体动力学及超微结构阐述针刺治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6月龄雄性SAMP8小鼠40只，6月龄雄性SAMR1小鼠20只，均购自天津中医药大学第一附属医院动物实验中心，动物质量合格证号0004582，小鼠体质量（25±3.5）g，均为清洁级动物，饲养于垫锯木屑的饲料笼中，自由摄食饮水，温度18～22 ℃、相对湿度40%～50%，光照充足和通风。适应性喂养1周后，将SAMP8小鼠按随机数字表分为针刺组、模型组，每组20只，另取雄性SAMR1小鼠作为正常组。本实验经中南大学湘雅三医院实验动物伦理委员会批准[批准号LLSC（LA）2014-030]。实验过程中操作按照国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准进行。

1.2 主要试剂与仪器

一抗Fis1兔抗试剂盒（美国Proteintech Group公司），一抗OPA1兔抗试剂盒（美国Proteintech Group公司），复合二抗试剂盒（HRP-Polymer anti ms/rbIgG，迈新公司），Bradford蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）。透射式电子显微镜（日本日立公司，型号H-600），超薄切片机（瑞典BROMMA公司，LKB-V型），低温冰箱（BCD-256KFB），华佗牌针灸针（0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂），Morris水迷宫（中南大学湘雅三医院）。

1.3 干预

针刺组选取“百会”“血海”“肾俞”“膈俞”，“百會”向后平刺3～5 mm，“血海”“肾俞”直刺2～3 mm，“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，其中“血海”“肾俞”“膈俞”先刺激左侧穴位，次日再刺激右侧，交替进行。小鼠穴位定位以及针刺深度参照国家十五规划教材《实验针灸学》中“动物针灸穴位图谱”[10]及相关文献[11]。进针后，补泻手法参考针刺手法量学标准[12]：“血海”“膈俞”施捻转泻法，施针幅度180～360°，频率50～60次/min；“肾俞”“百会”施捻转补法，施针幅度60～90°，频率120～150次/min，运针1 min，留针10 min。模型组和正常组小鼠进行与上述相同时间程度的捉抓刺激。每日处理1次，第7日暂停1次，连续干预8周。

1.4 行为学测试

针刺结束后，Morris水迷宫实验检测小鼠行为学。前4 d为隐蔽平台实验，最后1 d进行空间探索实验。Morris水迷宫由4个象限组成，直径160 cm，水深40 cm。平台直径15 cm，位于象限Ⅰ中心，隐匿于水下2 cm，水温保持25～27 ℃。在4个象限池壁中点做标记，作为小鼠的入水点。测试时，将小鼠面向池壁，分别从4个入水点放入水池，记录小鼠从入水到找到平台所需的时间，即逃避潜伏期。小鼠找到平台后，让其在平台上站立20 s。若60 s内小鼠未找到平台，则将其从水中引导到平台上并停留20 s，并将该次成绩记为60 s，然后进行下一象限训练。每只小鼠从4个入水点分别放入水池为1次训练，每日训练1次，连续4 d。第5日时，进行空间探索实验，撤去平台，每只小鼠从象限Ⅲ入水点放入水池，记录其在60 s内穿越原平台的次数及在原平台所在象限游泳的时间占总时间的百分比。

1.5 Western blot检测

针刺干预8周后，将每组中15只小鼠断头处死，无菌条件下冰台上分离海马组织，剪取约0.5 mg组织，置于组织匀浆器中，加入1 mL总蛋白提取液，匀浆5～20 min充分破碎，置于冰上10～20 min后，再匀浆5～20 min，将匀浆液吸出，置于1.5 mL离心管。Bradford法测定蛋白质含量，SDS-PAGE电泳，转膜，考马斯亮蓝R-250染色，加入一抗，室温下于摇床孵育2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，化学发光，得到胶片。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。