耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺炎的全球倡议-文献阅读 SIFIC感染网
张少言 张晔敏 吴定中 马子风 钱家骅 张惠勇 鹿振辉
摘要：目的 观察清金颗粒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）肺炎模型小鼠的干预效应。方法 采用菌液滴鼻法制作肺炎小鼠模型。将实验小鼠随机分为空白组、模型组、西药组和中药组，造模后第3日开始给药，西药组给予利奈唑胺灌胃，中药组给予清金颗粒灌胃，空白组和模型组给予生理盐水灌胃。造模后每日观察小鼠体质量变化及临床表现，第3、10日CT检测肺部影像学变化，HE染色观察肺组织病理变化，检测肺部载菌量。结果 造模组小鼠感染后第1日体质量显著下降，感染后第3日肺部CT示两肺充满炎性渗出物；给药后第7日中药组较模型组小鼠肺部炎症明显减轻，炎性渗出物减少，仅有散在炎性渗出物，同时肺部炎性病理表现减轻，且肺部载菌量明显降低（P<0.05），但较西药组效果稍差（P<0.05）。结论 清金颗粒能够显著降低小鼠肺部载菌量，减少肺组织炎细胞浸润，对MRSA感染肺炎小鼠有治疗作用。
关键词：清金颗粒；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；肺炎；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0055-04
Effects of Qingjin Granules on Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus Pneumonia Mice
ZHANG Shao-yan， ZHANG Ye-min， WU Ding-zhong， MA Zi-feng，
QIAN Jia-hua， ZHANG Hui-yong， LU Zhen-hui
Longhua Hospital Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200032， China
Abstract： Objective To observe the effects of Qingjin Granules on methicillin-resistant staphylococcus aureus （MRSA） pneumonia mice. Methods Pneumonia model was prepared by intranasal drip of bacterial fluid. Experimental mice were randomly divided into control group， model group， Western medicine group and TCM group. On the third day after infection， the Western medicine group was treated with linezolid， and the TCM group was given Qingjin Granules for gavage. The control and model group were given the same amount of normal saline for gavage. Body weight and clinical manifestations every day of each mouse after infected were recorded. Lung scans at day 3 and day 10 were taken； the pathological changes trough HE staining were observed； microbial load of lung tissue was detected. Results There were significant weight losses on mice except control group on the first day after infection. CT scan showed that the lung inflammation was filled with mice on the third day after infection. The lung inflammation in the TCM group was more reduced than model group， with less inflammatory exudate and only scattered inflammatory exudates. Meanwhile， pulmonary inflammatory pathology was reduced and the amount of bacteria were reduced in the lungs of TCM group （P<0.05）， but it was less effective than linezolid （P<0.05）. Conclusion Qingjin Granules can significantly reduce the microbial load of the lung and infiltration of inflammatory cells in lung tissue of mice， achieving the efficacy of treating MRSA pneumonia in mice.
Keywords： Qingjin Granules； methicillin-resistant staphylococcus aureus； pneumonia； mice
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）是引起医院和社区相关性感染的重要致病菌之一，2010年我国临床分离菌耐药性监测结果显示，MRSA菌株的分离率达到51.7%[1]，在革兰阳性球菌中占第1位。目前临床用于治疗MRSA的万古霉素、利奈唑胺和替考拉宁等药物或不良反应显著，或价格昂贵[2]。有研究显示，中药提取物具有明显的抗MRSA作用[3-4]。清金颗粒是由全国名老中医邵长荣教授的芩部丹、三草颗粒、三参颗粒3个复方组合优化而成，具有清热解毒祛邪、益气养阴扶正的功效，长期用于多重耐药菌（MDRO）感染的临床验方。本实验建立MRSA感染性肺炎小鼠模型，采用清金颗粒对MRSA肺炎小鼠进行干预，并通过肺部CT、肺载菌量、肺组织病理变化观察清金颗粒对MRSA肺炎小鼠的影响，以期为MRSA感染性肺炎的治疗提供依据。
1 实验材料
1.1 动物
C57BL/6小鼠40只，SPF级，雄性，6～8周龄，体质量（20±5）g，上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲養于动物生物安全防护二级实验室。
1.2 药物
清金颗粒（黄芩12 g、百部18 g、丹参12 g、鱼腥草15 g、夏枯草15 g等），上海中医药大学附属龙华医院中药房；利奈唑胺片，Pfizer Pharmaceuticals LLC，批号H20130609。中药煎剂浓度及西药浓度均根据成人日服剂量，按体表面积法换算等效剂量。
1.3 主要试剂与仪器
MRSA菌株（ST239型，上海华山医院临床检验科），胰蛋白胨大豆琼脂培养基（BD-236950），戊巴比妥钠（美国Sigma公司，进口分装）。莱卡2135型石蜡切片机（德国莱卡公司），生物显微镜（德国莱卡公司），荧光相差正置显微镜（日本Nikon公司），台式恒温振荡器（浙江赛德仪器设备有限公司），小动物活体Micro-CT系统（美国GE公司）。
2 实验方法
2.1 菌液制备
从琼脂平板上挑取MRSA菌株，接种于TSA液体培养基中，37 ℃恒温振荡过夜。第2日取50 μL培养菌液重新接种到5 mL新的TSA培养基中，当细菌长至对数期时，将菌液离心去上清，收集细菌沉淀，用无菌PBS洗涤2次，悬浮细菌至1.0×109 CFU/mL。
2.2 造模
参考文献[5]方法制作MRSA感染性肺炎小鼠。除空白组外，其余各组小鼠均从左侧鼻腔滴入50 μL浓度为1.0×109 CFU/mL的MRSA菌液，空白组小鼠从左侧鼻腔滴入50 μL无菌生理盐水，接种后将小鼠身体直立并维持约1 min以保证菌液充分吸收，连续观察3 d。
2.3 分组及药物干预
实验小鼠适应性饲养5 d后，随机分为空白组、模型组、西药组和中药组，每组10只。感染3 d后，西药组和中药组小鼠分别给予0.4 mL利奈唑胺和清金颗粒药液灌胃，空白组和模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃，早晚各1次，连续7 d。
2.4 观察及检测指标
2.4.1 一般观察
观察小鼠活动和精神状况、饮水、饮食情况，每日称量小鼠体质量并记录。
2.4.2 肺部CT扫描
于感染后第3日随机选取空白组、模型组、西药组和中药组小鼠各2只，采用Micro-CT系统进行胸部CT扫描，第10日复查CT。
2.4.3 肺载菌量计数
感染后第10日，各组随机选取5只小鼠，处死后立即分离全肺，无菌条件下将全肺研磨成匀浆后在TSA培养基上铺板，37 ℃恒温箱中培养24 h，进行细菌计数。
2.4.4 肺组织病理观察
感染后第10日，将各组剩余5只小鼠麻醉，取全肺，于福尔马林液室温固定，脱水后石蜡包埋，切片，HE染色观察病理变化。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，正态分布数据组间比较用方差分析，非正态分布数据采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况
模型组小鼠感染后出现精神萎靡不振、毛发黯淡、反应迟钝、活动量变少，部分小鼠相互蜷成团状，饮水量和进食量减少；西药组和中药组小鼠感染3 d精神状态逐渐恢复，活动量、进食和饮水量有所增加；空白组小鼠在整个实验过程中活动及饮水饮食均正常，毛发有光泽，未出现明显异常。整个实验过程中各组小鼠均未发现死亡。MRSA菌液滴鼻后第1日，造模小鼠体质量显著下降。随感染时间的延长，各组小鼠体质量呈逐渐恢复态势。
4.2 肺部CT扫描变化
选取各组同一只小鼠第3、10日CT片中炎症最重的平面图对比发现：感染3 d时，模型组、西药组和中药组小鼠双肺充满炎性渗出物，提示有病变发生；空白组小鼠两肺轮廓和肺门结构清晰可见，气管和主要支气管通畅；给药7 d时，西药组和中药组小鼠肺部炎症较前减轻，炎性渗出物减少，仅有散在炎性渗出物；模型组小鼠肺部表现较之前无明显变化。
结果见图1、图2。
4.3 肺部载菌量变化
模型组小鼠肺部有大量MRSA，空白组小鼠肺部无MRSA，表明MRSA感染肺炎小鼠模型制作成功。中药组和西药组小鼠肺部载菌量较模型组显著减少（P<0.05），中药组小鼠肺部载菌量高于西药组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
4.4 肺组织病理变化
空白组小鼠气管上皮纤毛整齐排列，肺泡腔内无炎性分泌物，肺泡结构完好；模型组小鼠肺组织病理改变明显，支气管管腔狭窄，充满炎性渗出物，肺泡壁充血增厚，肺泡正常结构消失，肺泡腔内炎性细胞浸润，气管上皮纤毛脱落，部分纤毛消失；西药组小鼠肺组织与模型组比较，基本无炎性渗出物，肺组织结构清晰，炎症明显减轻；中药组小鼠肺组织结构清晰，部分肺泡及间质有炎性细胞分布，与模型组比较炎症明显减轻。结果见图3。
5 讨论
中医学将MRSA感染性肺炎归属于“风温肺热病”范畴，病变部位在肺，其主要病因病机为正气不足，感受风热毒邪，邪毒内伏。清金颗粒主要针对外感热病气阴两虚兼热毒内蕴，长期用于MRSA、耐多药结核分枝杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌等MDRO感染的治疗，均取得较好疗效[6-7]。
本研究CT结果显示，清金颗粒组小鼠肺部炎症较给药前明显减轻，炎性渗出物减少，仅有散在炎性渗出物。同时，清金颗粒能明显降低MRSA感染小鼠肺部的载菌量，但较利奈唑胺的效果差；能明显减轻MRSA感染小鼠肺部的炎性病理改变。CT结果与肺部载菌量及肺组织病理HE染色结果吻合。
清金颗粒治疗MRSA感染性肺炎的疗效确切，方中黄芩清热燥湿、泻火解毒。现代药理研究显示，黄芩中有效成分黄芩苷对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用[8]。百部有润肺止咳功效；丹参有活血化瘀、凉血功效。鹿衔草具有清热化痰、止咳功效，现代药理研究显示，萘醌类化合物作为鹿衔草中的有效成分，能对包括金黄色葡萄球菌在内的多种细菌产生不同程度的抑菌作用，但其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳[9]。鱼腥草有清热解毒、排脓利尿的功效，为治疗肺中有热、痰液脓稠之要药。体外抑菌试验显示，鱼腥草中有效成分癸酰乙醛对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用[10]。夏枯草能清泄肝内郁火、消散痰结、善泄肝胆郁火，用于肝郁化火的痰火壅聚证。王放银等[11]用关蝶法进行MRSA敏感性试验，发现夏枯草对MRSA有一定的抑菌作用，其对MRSA的抑菌环大于万古霉素。清金顆粒具有清热解毒、化痰逐瘀、益气养阴的功效。
本研究只观察了清金颗粒对MRSA肺炎的干预效应，其作用机制有待进一步研究。此外，小鼠感染MRSA后均出现体质量迅速下降后逐渐恢复，中药组小鼠体质量恢复较模型组低，考虑清金颗粒清热解毒效用优于益气养阴功效，凉药有碍脾胃运化吸收，需后续进行长周期实验进一步进行疗效验证。
综上，我们推测清金颗粒在治疗MRSA肺炎的过程中，通过对MRSA的抑菌作用减少炎性物质的渗出，同时增强机体的免疫功能起到增效的作用。
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