树突状细胞和VEGF在膀胱癌中的表达及其意义
谢梅茂 王忠军 胡映秋
【摘要】 目的：研究膀胱尿路上皮癌细胞中TET2蛋白及5hmC的表达量相关作用。方法：采用Real-time PCR检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿路上皮癌细胞中TET2 mRNA的表达，并同时采用细胞免疫化学染色检测正常尿路上皮细胞和膀胱尿路上皮癌细胞中5mC及5hmC表达，了解TET与膀胱癌的作用关系，并探讨其可能的作用机制。结果：TET2 mRNA在正常膀胱细胞T24中的表达（1.400 00±0.057 74，n=3），显著高于膀胱癌T739细胞[（0.866 70±0.120 20，n=3），P=0.016 1]；TET2蛋白在T739中表达（1.589 00±0.048 52，n=3）也明显低于T24[（1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7]。5-mC在两种细胞中的表达量比较差异无统计学意义（P=0.097 6）；5-hmC的表达量T739细胞明显低于T24细胞
[（1.840 00±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1）]。结论：TET2 mRNA和蛋白水平在膀胱肿瘤细胞中低表达，显著低于正常膀胱细胞；且TET2与5hmC低表达存在相关性。
【关键词】 TET2； 5hmC； 膀胱癌
TET2 Protein Downregulates Low Expression of 5hmC in Bladder Cancer Cell T739/XIE Meimao，WANG Zhongjun，HU Yingqiu，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：036-039
【Abstract】 Objective：To study the expression of TET2 protein and 5hmC in bladder urothelial carcinoma cells.Method：Real-time PCR was used to detect the expression of TET2 in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells mRNA，and at the same time immunohistochemical staining was used to detect 5mC and 5hmC in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells，TET and bladder cancer，and its possible mechanism of action was explored.Result：The expression of TET2 mRNA in normal bladder cells in
T24（1.400 00±0.057 74，n=3），was significantly higher than that of T739 cells of bladder cancer[（0.866 70
±0.120 20，n=3），P=0.016 1].The expression of TET2 protein in T739 was significantly lower than that of T24[（1.589 00±0.048 52，n=3） VS （1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7].There was no significant difference in the expression level of 5-mC between two kinds of cells（P=0.097 6）.The expression level of 5-hmC was significantly different，and the T739 cell group was significantly lower than that of T24 cell group[（1.840 00
±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1].Conclusion：TET2 mRNA and protein levels are low expression in bladder tumor cells，significantly lower than those of normal bladder cells，and there is a correlation between the low expression of TET2 and 5hmC.
【Key words】 TET2； 5hmC； Bladder cancer
First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.009
隨着相关诊疗技术的进展，膀胱癌的发病率与病死率在我国呈现逐年升高趋势，严重地危害着我国居民健康[1]。75%～85%初诊膀胱癌患者为非肌层浸润性肿瘤，经尿道手术治疗后，约20%进展为肌层浸润性膀胱癌，患者需行根治性手术切除膀胱，生活质量与预期寿命均显著下降[2]。膀胱癌是由多因素综合作用导致的，一个复杂的病理过程，与遗传、环境、免疫等密切相关。在肿瘤转移发生过程中，许多基因的表达将出现改变，尤其是肿瘤可通过上调转移促进基因（metastasis-promoting genes）的表达以及下调转移抑制基因（metastasis-suppressor genes）的表达来获得一些新的生物学特性，从而增强肿瘤细胞的侵袭及转移能力[3]。随着表观遗传学的研究进展以及检测方式的改进，5?羟甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）逐渐成为目前的研究热点。5hmC是由TET蛋白催化5?甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）去甲基化转化而来。近年来，人们对这一有趣的DNA研究有了很大的兴趣，了解TET蛋白和5hmC的相关性，进一步了解基因调控与疾病的关系。5hmC水平表达可能在各个方面发挥着重要作用病理生理过程，如血液学恶性肿瘤、黑色素瘤、神经退行性疾病和老化等[4-7]。然而，5hmC是否与膀胱肿瘤相关，目前尚无明确报道。本研究，拟通过检测膀胱癌细胞及正常膀胱上皮细胞中TET2及5hmC的表达，了解膀胱尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，并探讨其可能的作用机制。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞来源及培养 人类膀胱癌细胞株T739、人膀胱上皮细胞株T24由中科院上海细胞库提供。RPMI 1640细胞培养液购自Hyclone公司，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素购自Invitrogen公司。细胞置于培养皿中，放到37 ℃的条件下，5%CO2培养箱中传代培养。最终，取对数生长期的细胞进行本研究的相关实验操作。
1.2 RNA提取、反转录聚合酶链反应 Real-time PCR检测T739和T24细胞中TET2 mRNA的表达，利用TRIzol试剂（Invitrogen公司）分别提取T739与T24细胞的总RNA，合成cDNA。反应条件：（1）42 ℃ 30 min；（2）99 ℃5 min，反应产物-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，合成cDNA，进行real-time PCR反应。本研究中采用的TET2 mRNA的引物序列由上海生工生物工程公司合成：上游5-TTCTTCCCCATGACCAC-3下游5-ACGCTTGGAAG CAGGAGAT-3。PCR循环条件：（1）变性94 ℃ 30秒；（2）退火55 ℃45秒；（3）延伸65 ℃45秒，共循环30次；（4）72 ℃延伸5 min。分析最终的基因扩增结果，计算Ct值。采用GAPDH作为内参。每组设3个复孔，基因相对表达量（RQ）采用2-△△Ct方法计算。
1.3 蛋白质印迹法检测TET2蛋白表达量 采用
1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，凯基生物科技有限公司，Ltd，南京，中国）于冰上孵育0.5 h，裂解细胞。使用BCA蛋白检测试剂盒（凯基生物科技有限公司）检测蛋白浓度。细胞裂解液（16 μg）用6%十二烷基硫酸钠处理。聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜。采用含5%脱脂牛奶的TBST，室温封闭1 h。加入一抗，抗TET2（1∶500稀释，Abcam，美国）在4 ℃过夜。TBST洗涤后，印迹与二抗体孵育（1∶6 000稀释，cwbio）在室温下1 h。蛋白质密度分析Image J软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）
1.4 细胞免疫化学染色检测5mC和5hmC表达 T739与T24细胞去除培养基后，采用PBS冲洗3次，5 min/次。PBS清洗后，收集细胞放置于4%多聚甲醛，37 ℃固定15 min。固定后，再用PBS清洗细胞3次，5 min/次。将细胞置入预冷的甲醇处理10min，处理前甲醛需要置于-20 ℃冰箱预处理。PBS洗3 次。孵育一抗：5hmC为1∶500，Abcam，美国，4 ℃孵育过夜。一抗孵育后，PBS洗涤细胞，5 min/次，洗3次。孵育荧光二抗。两种抗体，抗体稀释度：AlexaFluor594为1∶800，AlexaFluor488为1∶400。二抗室温孵育，孵育60 min。PBS清洗后，用50%甘油/PBS封片观察。采用尼康荧光显微镜进行观察。采用Image ProPlus Version 4.0软件分析，检测荧光光度值。
1.5 统计学处理 以上实验均重复3次以上。统计学软件采用SPSS 19.0版（SPSS Inc.，Chicago，IL，美国），实验结果用（x±s）表示，先进行方差分析（F检验），两样本均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR检测TET2 mRNA的在T739和T24细胞的表达水平 TET2 mRNA在T739中的表达（1.400 00±0.057 74，n=3），显著高于T24细胞（0.866 70±0.120 20，n=3），差异有统计学意义（P=0.0161），见图1。
2.2 TET2 蛋白的在T739和T24细胞的表达水平 TET2蛋白在T739细胞中的表达为（1.589 00
±0.048 52，n=3），T24细胞为（1.310 00±0.049 33，
n=3），TET2蛋白在T739细胞中的表达明显高于T24细胞（P=0.015 7），见图2。
2.3 5mC和5hmC在T739和T24细胞的表达水平比较 5mC在T739和T24细胞的表达水平比较，差异无统计学意义（P=0.097 6），见图3；5hmC在T739细胞中的表达（1.840 00±0.055 68，n=3）明显高于T24细胞（1.487 00±0.041 77，n=3），差異有统计学意义（P=0.007 1），见图4。
3 讨论
5hmC是由TET家族蛋白催化产生的氧化产物，早在几十年前就被发现[8]。但是直到最近，研究者才在鼠的脑和胚胎干细胞中确定了5hmC的高表达，羟甲基话逐渐被人们所重视[9]。目前研究认为，5hmC是去甲基化的中间产物，通过移位或突变产生甲基化表型，从而破坏了TET蛋白质的功能。TET蛋白是5hmC的重要调节因子[10]。人TET蛋白家族共有3个成员，分别为TET1、TET2和TET3。TET1主要在胎儿组织和干细胞中表达，TET2在造血系统中含量较高，而TET3则在结肠和肌肉等组织中表达[11]。其中，TET2相关研究显示：约有20%骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者可以被检测出TET2突变；并且，相关结果与临床症状存在一定的相关性；有部分学者认为：TET2可以被作为一种良好的诊断标志物，指导精准治疗[12-13]。
在人类的不同组织中，5hmC表达存在明显的差异性。采用免疫沉淀等方法，Li等[14]发现在人脑组织中5hmC高表达约0.67%，在肝、肾、结直肠组织中表达量相对较低，在心、乳腺、胎盘组织内表达量更低，仅为0.05%～0.06%。本研究发现但去甲基化5mC即5hmC在肿瘤细胞中，也存在高表达的趋势。相对于T24的表达量，TET2作为5hmC的重要调节因子，在肿瘤细胞T739中mRNA和蛋白水平均明显降低，这与肿瘤与低甲基化水平相类似的结果。DNA甲基化，是最早被学者发现的表观遗传的修饰形式。TET2基因维持CpG岛的局部DNA甲基化，从而起到了阻止肿瘤细胞CPG异常甲基化的作用[15]。
最近的一項报告显示，脑部病变，特别是星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，随着肿瘤级别升高，5mC水平没有明显变化，但可以显著降低5hmC[16]；其他的研究也显示，相比于正常组织，肿瘤会降低5hmC的水平[17-18]。国内的一些学者在其他实体癌的相关研究中，也得到了相类似的结果：谢素红等[19]通过应用小干扰RNA沉默TET1基因表达，可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平，明显抑制786-O细胞的增殖，并使细胞阻滞于G1期，其机制可能与TET1调控SUZ12的表达，影响其靶基因对PRC2的招募有关。可能的猜想是：TET2突变导致活性丧失或功能丢失，阻止了5mC向5hmC转化，从而造成5hmC的降低，但由于体内其他代谢途径维持了5mC的平衡[20]。所以本研究中膀胱癌细胞中5hmC显著降低，但与正常细胞相比5mC水平无明显变化。
到目前为止，TET2蛋白是否在实体恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用仍有待进一步研究。虽然本研究发现了TET2、5hmC在膀胱肿瘤细胞中的高表达，提示TET2和5hmC可能成为膀胱癌诊断及治疗的新靶点，为了解膀胱尿路上皮癌发生发展过程中TET家族可能所起的作用，但具体相关机制尚需要进一步深入研究。
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（收稿日期：2017-11-30） （本文编辑：程旭然）
