四环素原粉
钟磊 卞芳 赵朝阳 张洪
[摘要] 目的 采用离子胶凝法制备盐酸四环素胃内漂浮微球，改善其胃内释药及抗幽门螺旋杆菌治疗时的疗效。 方法 选用壳聚糖及海藻酸钠为载体，以NaHCO3为起泡剂；通过正交试验考察海藻酸钠与药物用量比、壳聚糖浓度、CaCl2浓度、海藻酸钠与NaHCO3用量比等对其体外漂浮性能、体外释放、包封率、成球性的影响，筛选出最佳工艺。 结果 最优工艺条件：壳聚糖浓度为8 mg/mL，海藻酸钠与药物比例为4∶1，CaCl2浓度为20 mg/mL，海藻酸钠与NaHCO3比例为2∶1，所制备的盐酸四环素胃内漂浮12 h微球漂浮率为95%，包封率为79.90%，形态良好，体外试验具备缓释性。 结论 该盐酸四环素胃内漂浮微球达到了胃内滞留要求，可提高吸收及抗幽门螺旋杆菌疗效，减少口服给药次数，可解决现有上市剂型的不足。
[关键词] 盐酸四环素；胃内漂浮微球；壳聚糖；海藻酸钠；正交试验
[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0023-04
[Abstract] Objective To prepare Tetracycline Hydrochloride gastric floating microspheres using ionic gelation method， and to improve drug release percentage and therapeutic effect of anti-Helicobacter pylori. Methods Chitosan and alginate were chosen as the carriers， and NaHCO3 was utilized as the foaming agent. The orthogonal experiment was adopted to investigate the weight ration of tetracycline/alginate and alginate/NaHCO3， as well as the concentration of CaCl2 and chitosan. Therefore， the optimum preparation was determined by evaluating floating performances， drug release， encapsulation efficiency and balling index. Results The optimal conditions were as followed： the concentration of chitosan was 8 mg/mL， the weight ration of alginate/tetracycline was 4∶1， the concentration of CaCl2 was 20 mg/mL， and the weight ration of alginate/NaHCO3 was 2∶1. The microcapsules could float in stomach for 24 h with a floating rate of 95%， and the encapsulation efficiency was 79.90%. The in vitro experiments suggested that these floating microspheres had good sustain-release properties. Conclusion According to the results above， tetracycline gastric floating microspheres meet the requirements of gastric retention， which can increase drug absorption and therapeutic effect of anti-Helicobacter pylori， reduce dosing frequency， and have more selection of dosage forms.
[Key words] Tetracycline Hydrochloride； Gastric floating microspheres； Chitosan； Alginate； Orthogonal experiment
四環素是菲烷母核的广谱抗生素，抑制细菌蛋白合成，广泛应用于革兰阳性和阴性细菌感染。目前仍为立克次体感染、支原体感染、衣原体感染、螺旋体感染首选药物，同时因其耐药率较低，为抗幽门螺旋杆菌根除四联方案一线推荐药物[1-5]。四环素具有抑制基质金属蛋白酶活性、减少骨吸收、恢复成骨细胞的功能及结构、降低可诱导氮氧化物合成酶表达及其他前炎性细胞素等，体外可促进人胚成骨细胞的增殖及活性，促进Ⅰ型胶原、骨钙素等合成，目前其无抗菌活性异构体已用于观察治疗骨胶原分解过度的疾病[6]。四环素呈酸性，1%盐酸四环素溶液pH值为1.8～2.8[7]，碱性环境下发生降解失活，中性环境下可与金属离子生成不溶性螯合物，弱酸性环境发生差向异构化生成无抗菌活性异构体，口服仅有30%～40%经胃肠道吸收[8-9]。将盐酸四环素制成胃内漂浮微球后可使其长时间滞留在胃内，提高胃内药物浓度，改善吸收，减少服药频次，尤其能提高胃幽门螺旋杆菌的清除率。海藻酸钠与氯化钙、壳聚糖经电解质聚合后生成复合物[10-11]。壳聚糖可使海藻酸钙骨架的网眼堵塞，使制剂的稳定性提高并增加载药量，调整药物的释放速率[12-14]。本研究以盐酸四环素为原料，载体选用壳聚糖/海藻酸钠，选用离子胶凝法为制备方法，对处方及工艺进行研究。
1 仪器与材料
Cary100紫外-可见分光光度计（美国Varian）；XS105DU电子天平（Mettler Toledo公司）；HH-1电热恒温水浴锅（北京市科伟永兴仪器有限公司）；RE-2000旋转蒸发仪（上海越众仪器设备有限公司）；HL-C2000真空干燥箱（上海市华连医疗器械有限公司）；电子扫描显微镜（美国Amray）。
盐酸四环素药物（武汉远城科技发展公司，批号：151108-62）；盐酸四环素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：150486-200403）；壳聚糖（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150710）；海藻酸钠（青岛晶岩生物科技开发有限公司，批号：20150519）；NaHCO3（天津致远化学试剂有限公司，批号：20150707）；无水氯化钙（国药集团化学试剂有限公司，批号：20151116）；稀盐酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 盐酸四环素的测定
目前四环素含量测定有微生物法、分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、差示导数光谱法、差示分光光度法等[15-17]。本研究选用差示分光光度法，以蒸馏水为溶剂，取四环素标准品配置成0.2 mg/mL溶液，在300～500 nm波长范围扫描，测得四环素最大吸收波长为396 nm，同时做海藻酸钠及壳聚糖扫描，发现在此波长无吸收，对四环素测定无干扰。取不同浓度四环素标准液，分两组各加入0.01 mol/L稀盐酸、0.001 mol/L氢氧化钠。将酸性液作为参比，以碱性液为样品液，在396 nm处测得吸光度差值。绘制标准曲线，回归方程为Y = 0.0293X + 0.0102（r = 0.9973），线性范围：0.6～32 μg/mL。取盐酸四环素胃内漂浮微球研碎，称取粉末0.1 g加入100 mL量瓶，振荡溶解，微孔滤膜过滤，取滤液依前法396 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算盐酸四环素含量。
2.2 制备工艺
取盐酸四环素原料加入5 mL蒸馏水中，搅拌混匀，取适量的海藻酸钠和微晶纤维素（作为惰性成分，延缓药物释放）加入盐酸四环素溶液中，超声溶解5 min，得到混合溶液1。取一定比例稀盐酸、壳聚糖及无水氯化钙加入20 mL蒸馏水中，搅拌均匀后得到混合溶液2。将混合溶液1经注射器滴入混合溶液2中，2 min后加入一定量的NaHCO3，搅拌至15 min，过滤后蒸馏水清洗2次，放入真空干燥箱干燥（45℃），得到盐酸四环素胃内漂浮微球。
2.3 漂浮率测定
在100 mL模拟胃液中放入微球，以100 r/min、（37±0.5）℃下恒温搅拌12 h后统计漂浮微球的数量。计算公式：漂浮率=12 h后漂浮微球数量/总微球数量×100%。
2.4 包封率及载药量的测定
取0.2 g的四环素微球，研碎，加入10 mL的蒸馏水溶液超声溶解后加入量瓶，稀释到50 mL，混匀后经微孔滤膜过滤，取滤液2 mL，按前法测定其含量。计算公式：包封率=微球中盐酸四环素质量/投入盐酸四环素总质量×100%，载药量=微球中的盐酸四环素质量/载体总质量×100%。
2.5 体外释放度测试
模拟胃内生理环境，选择人工胃液为介质进行盐酸四环素胃内漂浮微球释放度测定。试验采用溶出度测定法，按载药量精密称取250 mg的微球，加入温度为（37.0±0.5）℃的人工胃液1000 mL，以100 r/min的速度搅拌，每隔1 h取样5 mL，同时补加5 mL人工胃液。样品以微孔滤膜过滤，加入蒸馏水定容至50 mL，以差示分光光度法计算各时间点样品液中盐酸四环素含量，计算各时间点释放率，绘制释放曲线。
2.6 圆整度测定
将一块光滑的玻璃平板置于水平台面上，取一定数量的盐酸四环素胃内漂浮微球置于玻璃平板上，测得的微球开始滚动时玻璃与水平台面间夹角为圆整度指标，其值越小，圆整度越好。
2.7 优化制备工艺
将预试验选定影响显著的4个单因素（壳聚糖浓度、海藻酸钠与药物比例、CaCl2浓度、海藻酸钠与NaHCO3比例），经正交试验优化并得到最佳处方。
2.7.1 实验设计 将4因素A[壳聚糖浓度（mg/mL）]、B（海藻酸钠与药物比例）、C[CaCl2浓度（mg/mL）]、D（海藻酸钠与NaHCO3比例）按L9（34）正交表进行实验，见表1。
2.7.2 实验结果 依预试验及单因素试验结果，选定圆整度、包封率、载药率、12 h漂浮率为处方评价指标，按表1中4因素3水平进行试验，实验結果见表2。依表2中各水平组合得到结果，经综合加权评分后进行数据分析，判断各因素对微球性能的影响程度，确定最佳工艺。
2.7.3 结果处理 处方以圆整度（g）、包封率（F1）、载药率（F2）、漂浮率（E）为评价指标，选用加权综合评分方法对实验数据进行分析。根据包封率、载药率的数值及其重要程度，二者的加权综合评分公式确定为F=F1+6F2，F值的权重定为1；漂浮率的权重值定为1；因圆整度值小，且对药物的释放存在影响，将其权重定为4。综合加权评分T=E+F-4g，T值越高，微球的综合性能越好。分析结果见表3。表3中R值越大，对结果的影响越高。可以得知各因素对微球的圆整度、包封率及载药量、漂浮率的影响依次为D（海藻酸钠与NaHCO3比例）>B（海藻酸钠与药物比例）>C（CaCl2浓度）>A（壳聚糖浓度），最佳的因素组合为A1B2C2D3。
2.8 重复性实验
通过正交试验筛选出最佳处方后，依最佳处方制备出三组盐酸四环素胃内漂浮微球，分别测定圆整度、漂浮率、包封率。见表4。由表4可见该处方工艺制备出的微球质量稳定，成球形态、包封率及载药率、漂浮性能均较好。另制备三组微球，依据“2.5”的方法测定盐酸四环素在各时间点的累积释放度，取其平均值绘制体外释放曲线。见图1。微球在第1小时释放度为49.33%，其后药物呈平稳释放，第12小时的释放度为95.60%。取微球在电子显示镜下观察，形态学结果见图2。
3 讨论
壳聚糖不溶于水，加入稀盐酸可提高其溶解度同时提升四环素的稳定性，起泡剂NaHCO3最终环节中加入，与混合液中的稀盐酸反应快速释放出CO2，CO2经包封入微球后可降低微球密度，获得漂浮性能，故海藻酸钠与NaHCO3用量比为处方工艺的关键。因四环素在强光及热环境下不稳定，制备过程在阴凉环境中进行，提高了微球的质量稳定性。
本研究通过以正交试验对各因素进行分析，得到了制备胃内漂浮微球的优化处方，经测试依此工艺制备的盐酸四环素胃内漂浮微球具有较好的综合性能和稳定性，为下一步剂型改进及临床实验打下了基础。
海藻酸钠为有生物相容性可降解线性链状阴离子聚合物，无毒副作用[18]。在酸性条件下，分子中的自由羧基和羟基和CaCl2接触后，Ca2+离子置换海藻酸钠中的部分氢离子及钠离子，形成凝胶，经固化后可形成微球。壳聚糖为天然的亲水性多糖，是一種聚阳离子电解质[19]。海藻酸钠与壳聚糖在电荷作用形成阴阳聚电解质[20]。本研究利用以上反应提高了胃内漂浮微球的包封率。
制备的微球第1个小时呈突释现象，考虑为盐酸四环素水中易溶，溶出速度快，加入的微晶纤维素水中难溶，形成的非水屏障不连续，导致盐酸四环素通过凝胶层速度较快所致，接下来小组将进一步优化处方工艺，改进其缓释性能。
微球体外试验示其可在12 h内稳定释药，相比普通口服片剂的服药频次3次/d，本制剂服药频次可减少至2次/d，尤其在抗幽门螺旋杆菌治疗组合方案中可与同组治疗药物用药频次保持一致，提高了患者的依从性，具有较好的临床使用价值。
[参考文献]
[1] 刘文忠，谢勇，陆红，等.第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J].中国实用内科杂志，2017，37（6）：509-524.
[2] Fallone CA，Chiba N，van Zanten SV，et al. The Toronto Consensus for the Treatment of Helicobacter pylori Infection in Adults [J]. Gastroenterology，2016，151（1）：51-69.
[3] Malfertheiner P，Megraud F，O'Morain CA，et al. Management of Helicobacter pylori infection—the Maastricht V/Florence Consensus Report [J]. Gut，2017，66（1）：6-30.
[4] Hunt RH，Xiao SD，Megraud F，et al. Helicobacter pylori in developing countries.World Gastroenterology Organisation Global Guideline [J]. J Gastrointestin Liver Dis，2011， 20（3）：299-304.
[5] Malfertheiner P，Megraud F，O'Morain CA，et al. Management of Helicobacter pylori infection—the Maastricht Ⅳ/ Florence Consensus Report [J]. Gut，2012，61（5）：646-649.
[6] Golub LM，Goodson JM，Lee HM，et al. Tetracyclines inhibit tissue collagenases. Effects of ingested low-dose and local delivery systems [J]. J Periodontol，1985，56（11 Suppl）：93-97.
[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：907.
[8] Ovcharova GD，Arzamastsev AP. Stability of tetracycline hydrochloride [J]. Pharmaceutical Chemistry Journal，1980， 14（7）：475-479.
[9] 平其能，郑樑元，刘国杰，等.四环素混悬剂稳定性的研究[J].南京药学院学报，1982（3）：43-49.
[10] Gserd O，Smidsrd O，Skjk-Braek G. Microcapsules of alginate-chitosan—I.A quantitative study of the interaction between alginate and chitosan [J]. Biomaterials，1998， 19（20）：1815-1825.
[11] Ribeiro AJ，Silva C，Ferreira D，et al. Chitosan-reinforced alginate microspheres obtained through the emulsification/internal gelation technique [J]. Eur J Pharm Sci，2005， 25（1）：31-40.
[12] 魏靖明，张志斌，冯华林，等.海藻酸钠作为药物载体材料的研究进展[J].化工新型材料，2007，35（8）：20-22.
[13] Gombotz WR，Wee SF. Protein release from alginate matrices [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，1998，31（3）：267-285.
[14] Polk A，Amesden B，Yao KD，et al. Controlled release of album from chitosan-alginate microcamsules [J]. J Pharm Sci，1994，83（1）：178-181.
[15] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京：化学工业出版社，2005：484.
[16] The United States Pharmacopoeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia [M]. Rockville：The United States Pharmacopoeia Inc，1995：1510.
[17] 李好枝，于秀莲，孔璋，等.差示分光光度法测定盐酸四环素片含量[J].沈阳药科大学学报，2001，18（3）：201-203.
[18] 刘丹，王鹏程，刘昕，等.多柔比星海藻酸钙微球的制备及其载药、释药性质的研究[J].中国新药杂志，2006，15（15）：1260-1263.
[19] 王小红，马建标.甲壳素、壳聚糖及其衍生物的应用[J].功能高分子学报，1999（2）：197-202.
[20] Yadav SK，Khan G，Bonde GV，et al. Design，optimization and characterizations of chitosan fortified calcium alginate microspheres for the controlled delivery of dual drugs [J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol，2017，23：1-14.
