相关炎性因子在脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠血清和结肠组织的动...

刘香玉++刘永华++李海龙++刘峰林++程小丽++吴玉泓

摘要：目的 观察久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠髓样分化因子88（MyD88）和白细胞介素受体相关激酶1（IRAK1）表达的影响，探讨其作用机制。方法 采用复合方法制作动物模型。90只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组和久泻灵高、中、低剂量组，各给药组给予相应药物灌胃。RT-qPCR、免疫组化和Western blot分别检测MyD88、IRAK1基因和蛋白的表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠MyD88、IRAK1基因和蛋白表达均增强（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠MyD88、IRAK1基因和蛋白表达均减弱（P<0.01），久泻灵颗粒高剂量组最为明显。结论 久泻灵颗粒可抑制MyD88、IRAK1的表达，影响MyD88信号通路的传导，阻滞下游炎症因子的释放，从而达到治疗脾肾阳虚型UC的目的。

关键词：久泻灵颗粒；溃疡性结肠炎；脾肾阳虚；髓样分化因子88；白细胞介素受体相关激酶1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）09-0051-04

Effects of Jiuxieling Granules on Expressions of MyD88 and IRAK1 in Ulcerative Colitis Rats with Spleen-Kidney Yang Deficiency LIU Xiang-yu1， LIU Yong-hua1， LI Hai-long1，2， LIU Feng-lin1， CHENG Xiao-li1， WU Yu-hong1，2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Gansu Province Chinese Medicine New Products Engineering Laboratory， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Jiuxieling Granules on the expressions of MyD88 and IRAK1 in ulcerative colitis model rats with spleen-kidney yang deficiency； To discuss its mechanism of action. Methods Animal models were established by compound methods. 90 Wistar rats were randomly divided into blank group， model group， positive medicine group， and Jiuxieling Granules high-， medium-， and low-dose groups. Each administration group was given relevant medicine for gavage. RT-qPCR， SP immunohistochemistry and Western blot were used to detect mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in colon tissues. Results Compared with the blank group， mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in the model group increased （P<0.01）. Compared with the model group， mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in each administration group decreased （P<0.01）， especially in Jiuxieling Granules high-dose group. Conclusion Jiuxieling Granules can reduce the expressions of MyD88 and IRAK1， and then influence the transmission of MyD88 signaling pathway and block the release of downstream inflammatory factors to achieve the result of treating ulcerative colitis with spleen-kidney yang deficiency.

Key words： Jiuxieling Granules； ulcerative colitis； spleen-kidney yang deficiency； MyD88； IRAK1； rats

潰疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种反复发作的慢性非特异性炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD），属于中医学“久痢”“久泻”范畴，临床常见腹痛腹泻伴里急后重、黏液脓血便等症状，脾肾阳虚型UC在临床最为常见[1]，其病因尚不明确，目前认为与自身免疫密切相关[2]。有研究显示，

基金项目：国家自然科学基金（81260520）

通讯作者：吴玉泓，E-mail：172924249@qq.com

TLRs/MyD88信号通路在UC发病中起重要作用[3]。本研究选择MyD88依赖信号通路中的髓样分化因子88（MyD88）和白细胞介素受体相关激酶1（IRAK1）作为效应指标，观察其在脾肾阳虚型UC模型大鼠结肠组织基因和蛋白的表达。久泻灵颗粒是以四神丸合理中丸为主方，功效温补脾肾。课题组前期研究表明，久泻灵颗粒对大鼠结肠黏膜局部过激的免疫炎症反应有治疗作用，其治疗效果与治疗时间呈正相关[4-5]。在此基础上，本实验就不同剂量久泻灵颗粒治疗脾肾阳虚型UC的效果，研究其药物量效关系。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠90只，雌雄各半，鼠龄5～7周，体质量（170±20）g，甘肃中医药大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室。

1.2 药物

大黄水煎液，甘肃中医药大学附属医院；氢化可的松注射液，国药集团容生制药有限公司，批号1406418-A11；久泻灵颗粒（补骨脂∶人参∶干姜∶炒白术∶炙甘草∶五味子∶肉豆蔻∶吴茱萸=4∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶1），甘肃省众友健康医药股份有限公司；柳氮磺吡啶肠溶片（SASP），上海信谊天平药业有限公司，批号09141010。

1.3 主要试剂与仪器

TNBS（Sigma公司），MyD88、IRAK1基因上下游引物（大连宝生物公司），反转录试剂盒、扩增试剂盒（Promega公司），浓缩型DAB底物液、DAB溶液、兔SP试剂盒（中杉金桥），SDS-PAGE凝胶、BCA蛋白定量试剂盒（Solarbio公司），MyD88、IRAK1一抗（ImmunoWay）。电动匀浆器、冷冻高速离心机（Biofuge-Stratos），Bio-Rad荧光定量PCR仪（CFX96），BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司），MIE图像处理系统（山东易创电子有限公司），显微镜（日本Olympus，CX21型），Benchmark Plus连续波长酶标仪（Bio-rad），核酸转印系统（Bio-rad，Mini Protean），电泳仪（BIO-RAD，PowerPac Universal），凝胶成像分析系统（Bio-rad，CHEMI DOC XRS+）。

2 实验方法

2.1 分组和造模

实验大鼠适应性喂养7 d，按性别及体质量随机数字表法分为空白组、模型组、阳性药组和久泻灵高、中、低剂量组，每组15只。采用大黄水煎液灌胃+肌注氢化可的松+TNBS+乙醇灌肠法[6-7]复制脾肾阳虚型UC大鼠模型，除空白组外，其余各组大鼠每日上午予大黄水煎液灌胃，每日下午予蒸馏水灌胃，2 mL/只，共14 d，造成脾虚模型，空白组大鼠给予等体积蒸馏水；在此基础上，第15日大鼠左右肢臀部交替肌注氢化可的松25 mg/（kg·d），共10 d，造成脾肾阳虚模型；第25日禁食不禁水，第26日给予100 mg/kg TNBS+50%乙醇灌肠，空白组给予等体积蒸馏水灌肠，完成病证结合动物模型。

2.2 给药

造模后第2日开始药物干预灌胃，1次/d。久泻灵高、中、低剂量组每日分别给予（通过体型系数换算大约为正常成人剂量的10、5、2.5倍）13.5、6.75、3.375 g原药材/kg药液灌胃，阳性药组按0.2 g/kg剂量给予SASP灌胃，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，共21 d。

2.3 标本采集

各组大鼠于造模21 d末禁食不禁水24 h，水合氯醛麻醉，剖腹截取大鼠整个结肠组织，纵轴剪开，生理盐水反复清洗，装入标记的冻存管，-80 ℃保存。

2.4 指标检测

2.4.1 RT-qPCR检测髓样分化因子88和白细胞介素受体相关激酶1 mRNA表达 提取总RNA，反转录合成cDNA，引物序列见表1。PCR扩增反应：反应体系为25 μL，预变性，PCR反应循环40次，溶解，取各组Ct值，ΔCt=Ct值目的基因-Ct值GAPDH，2-ΔΔCt法计算相对表达量，重复3次，取其平均值。

2.4.2 免疫组化和Western blot检测髓样分化因子88和白细胞介素受体相关激酶1蛋白表达 免疫组化：石蜡切片、脱蜡，去离子水孵育、封闭；滴加MyD88、IRAK1抗体孵育，滴加生物素化山羊抗兔IgG孵育，辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育，滴DAB液后室温显色；苏木素轻度复染，自来水返蓝，脱水透明，中性树胶封片；每组取切片4张，每张切片光镜下取8个视野观察，应用医学图像分析系统分析平均光密度。Western blot：提取蛋白，按说明滴加BCA蛋白定量试剂，酶标仪测OD值，计算蛋白浓度，buffer（5×）进行蛋白变性；蛋白电泳，转膜；免疫反应：封闭，一抗孵育，二抗孵育，化学发光；凝胶图像分析，每个目标带密度与GAPDH密度的比值进行定量分析作为蛋白的相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

空白组大鼠反应敏捷，饮食、活动情况正常，精神佳，毛发柔顺有光泽，粪便呈棕褐色颗粒。模型组大鼠造模第14日开始出现蜷卧、扎堆倦怠、毛色晦黯、食量减少、体质量减轻、大便质软等脾肾阳虚的症状；病证结合造模后均出现稀便、黏液便、部分可见脓血便、肛周污秽、精神萎靡、倦怠、畏寒、体型消瘦、成群蜷缩或弓背、毛发枯槁疏散无光泽等症状。经药物治疗后，久泻灵各剂量组大鼠毛发洁净，反应较灵活，精神、饮食尚可，大便基本成形，个别出现软便，其中，久泻灵高剂量组大鼠毛发洁净有光泽，反应灵敏，大便呈颗粒状，显著恢复。实验过程中模型组死亡3只，久泻灵高剂量组死亡2只，久泻灵中剂量组死亡2只，久泻灵低剂量组死亡3只，阳性药组死亡4只。

4.2 久泻灵颗粒对模型大鼠结肠黏膜形态学的影响

各组大鼠结肠组织黏膜形态学评分参照Luketal标准[8]。与空白组比较，模型组评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组评分不同程度降低（P<0.01），且以久泻灵高剂量组最为明显。結果见表2。

4.3 久泻灵颗粒对模型大鼠结肠髓样分化因子88和白细胞介素受体相关激酶1基因表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织MyD88、IRAK1基因表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药大鼠结肠组织MyD88、IRAK1基因表达明显下降（P<0.01），且以久泻灵高剂量组尤为明显。结果见表3。

4.4 久泻灵颗粒对模型大鼠结肠组织髓样分化因子88和白细胞介素受体相关激酶1蛋白表达的影响

4.4.1 免疫组化结果 空白组组织形态正常，MyD88和IRAK1在肠黏膜及下层表达微弱；模型组肠黏膜有缺损，肠黏膜及下层见多量黄色颗粒浸润，MyD88、IRAK1阳性表达明显上调；久泻灵高剂量组MyD88存在散在黄色颗粒浸润黏膜间质，IRAK1表达为弱阳性，但与空白组比较仍升高；久泻灵中剂量组肠黏膜层见少量MyD88阳性表达，IRAK1中强度阳性表达，黄色颗粒减少；低剂量组在组织黏膜层、黏膜下层见较大量MyD88阳性表达，散在分布IRAK1阳性表达，均弱于模型组；阳性药组肠黏膜组织轻度炎性改变，MyD88、IRAK1见个别弱阳性表达，间质黄色颗粒少见，见图1、图2。与空白组比较，模型组MyD88、IRAK1表达增强（P<0.01）；与模型组比较，各给药组MyD88、IRAK1表达减弱（P<0.01），且以久泻灵高剂量组最明显。结果见表4。

5 讨论

MyD88是Toll样受体（TLRs）信号通路中的重要衔接蛋白，Toll样受体可通过MyD88依赖途径及非MyD88依赖途径向下游进行信号传递，TLRs活化后MyD88募集原本稳定结合于Tollip的IRAK家族成员，磷酸化IRAK1组成联合体IRAK1-MyD88，此联合体可高度磷酸化自身激酶导致IRAK1从MyD88与Tollip分离后参与下游反应，最终激活核因子-κB引起一系列炎症反应，造成组织损伤。

本实验结果表明，病证结合造模后大鼠饮食、精神活动、毛发、大便性质均发生改变；对大鼠结肠黏膜形态学进行评分，模型组远高于空白组而各给药组评分不同程度降低。RT-qPCR、免疫组化和Western blot结果均显示，模型组较空白组MyD88和IRAK1无论在mRNA还是蛋白水平均明显升高，提示脾肾阳虚型UC模型与MyD88依赖信号通路的异常表达密切相关；各给药组较模型组基因及蛋白水平不同程度降低，其中久泻灵颗粒高剂量组最为明显，表明久泻灵颗粒可抑制MyD88依赖信号通路下游分子达到抗炎作用，以此来减轻炎症反应对结肠黏膜的损伤，促进结肠黏膜的修复。

久泻灵颗粒以四神丸为君药，重用补骨脂，取其辛苦大温之药性，补命门之火以温脾土，针对肾虚泄泻；理中丸作臣药，其功效温中祛寒，补气健脾是为温补并用，先天之本与后天之本互资互生；佐以肉豆蔻温暖脾胃配合君药温肾暖脾，再佐酸味之五味子，固肾涩肠，止泻之力加倍；吴茱萸药性辛苦大热，温暖肝脾肾而散寒，可辅君臣温涩止泻之功。

综上，久泻灵颗粒可抑制TLR4/MyD88依赖信号通路中MyD88、IRAK1的表达，从而减弱炎症反应，保护修复结肠组织，高剂量久泻灵颗粒治疗脾肾阳虚型UC疗效最佳。

参考文献：

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[2] ZHU H， LI Y R. Oxidative stressand redox signaling mechanisms of inflammatory bowel disease：updated experimental and clinical evidence[J]. Exp Biol Med，2012，237（5）：474-480.

[3] 周毅骏，钦丹萍，杨新艳，等.雷公藤多苷片对溃疡性结肠炎大鼠miR-146a、miR-146b及TLR4/MyD88依赖信号通路的调控作用研究[J].中草药，2016，47（10）：1723-1730.

[4] 吴玉泓，许雅清，李海龙，等.久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠TLR4及NF-κB p65表达的影响[J].中国实验动物学报，2016，24（1）：47-52.

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[6] 吴玉泓，许雅清，李海龙，等.脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型的建立[J].中国实验动物学报，2016，24（2）：116-119.

[7] 陈贤坤，王立峰，赵慧，等.强肌健力方对脾肾两虚大鼠细胞因子水平的影响[J].放射免疫学杂志，2010，23（3）：282-283.

[8] 国家中医药管理局医政司.中医临床诊疗术语[M].北京：中国标准出版社，1997.

（收稿日期：2016-12-03）

（修回日期：2016-12-21；編辑：华强）