水环境对大鼠下丘脑垂体肾上腺皮质轴激素的影响
吴雪芬+岳增辉+郑雪娜+郭鑫+谢志强+谢莉娜
摘要：目的 观察按经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴相关激素含量及腧穴配伍效应的影响，探讨针刺治疗失眠症的作用机制。方法 腹腔注射对氯苯丙氨酸混悬液建立失眠模型大鼠。将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组，每组12只。各治疗组针刺相应腧穴，每次30 min，连续7 d。ELISA检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）及血清促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）的含量。结果 与模型组比较，各针刺组大鼠下丘脑CRH及血清ACTH、CORT的含量均有一定程度降低；各针刺组间比较，百会+神门组的疗效优于百会+三阴交组及百会+非经非穴组。结论 针刺可能通过调节HPA轴相关激素水平起到镇静安神的作用，按经选穴针刺可能是影响腧穴配伍效应的影响因素之一。
关键词：针刺；失眠；下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴；按经选穴；腧穴配伍；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.013
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0053-05
Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture treatment on the levels of HPA axis related hormones and acupoint compatibility in insomnia rats； To discuss the mechanism of action for acupuncture treatment. Methods Chlorophenylalanine suspension was under intraperitoneal injection to establish insomnia model rats. Sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui+Shenmen group， Baihui+Sanyinjiao group， Baihui+non-acupoint group， with 12 rats in each group. Each treatment group received acupuncture in relevant acupoints， 30 min each time， for 7 d. ELISA was used to measure the levels of CRH， ACTH and CORT. Results Compared with the model group， the levels of CRH， ACTH and CORT of the acupuncture groups decreased to some extent. In the three acupuncture groups， the efficacy of Baihui+Shenmen group was better than that of Baihui+Sanyinjiao group and Baihui+non-non-acupoint group. Conclusion Acupuncture treatment may calm and soothe the nerves to release the insomnia through regulating HPA axis related hormones. Acupuncture acupoints at different meridians may be one of the factors that cause the difference of acupoints compatibility effect.
Key words： acupuncture； insomnia； HPA axis； acupoints at different meridians； acupoints compatibility； rats
失眠可導致人或动物思维紊乱，常伴有疲劳及不良的情绪变化等症状。自1969年国外学者提出5-羟色胺（5-HT）致眠学说后，有研究发现，下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的兴奋-抑制状态是反应睡眠质量的重要指标，正常情况下，睡眠早期非快眼动
睡眠（NREM）占优势，此时HPA轴分泌活动受抑制，而睡眠后期快动眼睡眠（REM）占优势，HPA轴分泌活动则活跃[1]。氯苯基丙氨酸（PCPA）失眠模型大鼠在下丘脑5-HT含量降低的同时伴有HPA轴的功能紊乱，分布于下丘脑的室旁核和蓝斑核的促肾上腺皮质激素释放因子（CRF），以及血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）是直接反映HPA轴兴奋-抑制状态的相关激素[2]，CRF既可以调控蓝斑核NE系统与背缝核5-HT系统活性，又作用于下丘脑的CRF受体，调控HPA轴的功能。因此，HPA轴功能紊乱与失眠症关系密切[3-4]。有研究表明，针刺治疗改善失眠患者睡眠症状的疗效显著[5]。临床上针刺治疗失眠症的选穴方法多样，正确的腧穴配伍是提高针刺疗效的关键因素之一。不同的腧穴配伍方式对针刺治疗失眠的疗效有显著的影响[6]。本研究通过观察按经选穴对失眠大鼠HPA轴相关激素含量及腧穴配伍效应的影响，探讨针刺治疗失眠症的疗效机制，为临床针灸治疗该病提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
SPF级SD雄性大鼠60只，8～9周龄，体质量220～250 g，湖南中医药大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。正式实验开始前，大鼠适应性分笼饲养1周，每笼5只。饲养于湖南中医药大学实验动物中心实验室，温度23～26 ℃，湿度45%～65%。饲养1周后将大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组，每组12只。endprint
1.2 主要试剂和仪器
PCPA，美国Sigma公司；戊巴比妥钠，Merck公司；碳酸氢钠片，成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠片，成都市科龙化工试剂厂生产；阿拉伯胶，天津市光复精细化工研究所。动物型超纯水机，摩尔公司；PHSJ-3F型pH笔，上海精密科学仪器有限公司；pH精密试纸（pH值5.5～9.0），垫中垫公司；电热水恒温杯，Promega公司；台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；自动平衡离心机，湘仪离心机仪器有限公司；全自动酶标洗板机，汇松科技发展有限公司；多功能酶标分析仪，汇松科技发展有限公司；恒温培养箱，Promega公司；0.25 mm×25 mm华佗牌一次性使用无菌针灸针，苏州医疗用品厂。
1.3 造模
实验开始前，先将大鼠适应性喂养7 d，自由摄食饮水，保持垫料干燥，7 d后称重。参照文献[7]方法造模，除空白组外，其余各组于第8日腹腔注射PCPA混悬液，每日1次，连续2 d，制造失眠模型大鼠。空白组腹腔注射等体积弱碱性生理盐水。成模标准：失眠大鼠出现昼夜节律缺失、日间与夜晚皆活动不断、对外界刺激异常敏感、烦躁不安等相关症状。首次注射PCPA 36 h后，观察模型組大鼠生理状态，结合采用经典的戊巴比妥钠翻正实验，预实验测得戊巴比妥钠按体质量35 mg/kg为引起100%大鼠睡眠的最小阈剂量，以50 mg/mL浓度溶于生理盐水后进行腹腔注射，提起大鼠尾巴，腹部朝上放在平台上，记录大鼠睡眠潜伏期和睡眠时间。以大鼠翻正反射消失为睡眠，以大鼠翻正反射恢复为觉醒，注射戊巴比妥钠到翻正反射消失之间为潜伏期，翻正反射消失到觉醒为睡眠持续时间。观察空白组和与模型组大鼠睡眠潜伏期及睡眠时间的差异，进行失眠模型评价。
1.4 干预
造模完成后，于第2次注射PCPA的第1日后，开始对实验大鼠进行干预。空白组大鼠常规饲养，不做任何处理。模型组大鼠予仰卧位束缚于鼠板上，只捆绑，不进行针刺，每日1次，每次30 min，连续7 d，每日捆绑结束后正常进食。各针刺组大鼠选穴参考《实验针灸学》[8]穴位定位。百会+神门组选取“百会”、双侧“神门”，百会+三阴交组选取“百会”、双侧“三阴交”，百会+非经非穴组选取“百会”“非经非穴点”，非经非穴点参照成都中医药大学制定的选穴方法，此点在非经脉循行路线上及非穴位所在部位（位于肘内侧，肘尖与腋窝连线中点）。将大鼠仰卧位束缚于鼠板上，定穴后局部剪毛，络合碘消毒，采用0.25 mm×25 mm针灸针进行针刺。针刺方法：百会从后向前平刺20 mm，神门直刺1 mm，三阴交直刺5 mm，非经非穴点直刺5 mm。留针30 min，每10 min行针1次，行针时间1 min，行平补平泻手法，捻转幅度和频率均采用均等手法，30 min后行针结束后出针，每日1次。治疗后正常进食，连续7 d。
1.5 行为学观察
每日观察大鼠精神状态、动作灵敏性、反应敏捷性、昼夜节律、毛发光泽度、体质量变化以及活动度、饮食量、饮水量等与失眠症相关的伴随症状。
1.6 生化指标检测
末次行为学检测后禁食不禁水12 h，断头处死大鼠，取材。取3 mL血液，室温自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min离心20 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱备用；取下丘脑，称重，加一定量的pH 7.4 PBS，置于-80 ℃冰箱保存备用。标本融化后仍保持2～8 ℃的温度，再加一定量的PBS，将标本匀浆充分，2000～3000 r/min离心20 min，收集上清液，分装后1份待检测，其余冷冻备用。ELISA分别检测血清ACTH、皮质酮（CORT）及下丘脑CRH含量，严格按照试剂盒说明书进行检测。通过试剂盒提供的标准品进行梯度稀释，获得不同介质的标准曲线。在微量滴定板上加样，空白孔不加，标准品孔加标准品50 μL，加酶50 μL，待测样品孔加样品40 μL，然后各加二抗和酶标试剂，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37 ℃温育60 min。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。小心接掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。每孔加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色10 min。每孔加终止液50 μL终止反应。以空白调零，450 nm波长处依序测量各孔吸光度（OD）。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值通过回归方程计算出对应的样品浓度。
1.7 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠死亡情况
实验过程中共有7只大鼠死亡，其中模型组4只，百会+三阴交组1只，百会+非经非穴组2只。
2.2 戊巴比妥钠睡眠实验结果
空白组造模前后睡眠潜伏期和睡眠时间差异均无统计学意义（P>0.05）；与造模前比较，造模后睡眠潜伏期显著延长（P<0.05），睡眠时间显著减少（P<0.05），提示造模成功。见图1、图2。
注；与空白组比较，#P<0.05
2.3 一般状况
与空白组比较，模型组大鼠出现昼夜节律消失，日间活动不停，对外界的声，光等刺激异常敏感，烦躁不安，兴奋性增高，攻击性增强，毛硬粗糙，毛竖起无光泽，大便色泽灰白，持续观察1周，期间体质量增加缓慢、饮食量明显减少、饮水量明显增多，以上失眠症伴随症状提示造模成功。
2.4 按经选穴针刺对失眠大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠下丘脑CRH含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，百会+神门组、百会+三阴交组大鼠下丘脑CRH含量明显降低（P<0.01），百会+非经非穴组大鼠下丘脑CRH含量变化不明显；与百会+神门组比较，百会+三阴交组大鼠下丘脑CRH含量变化不明显；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠下丘脑CRH含量升高（P<0.05）。见图3。endprint
注：与空白组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较，▽▽P<0.01；
与百会+三阴交组比较，■P<0.05
2.5 按经选穴针刺对失眠大鼠血清促肾上腺皮质激素含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清ACTH含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各针刺组大鼠血清ACTH含量显著降低（P<0.05，P<0.01）；与百会+神门组比较，百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠血清ACTH含量明显升高（P<0.01）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠血清ACTH含量变化不明显。结果见图4。
2.6 按经选穴针刺对失眠大鼠血清皮质酮含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清CORT含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各针刺组大鼠血清CORT含量显著降低（P<0.01）；与百会+神门组比较，百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠血清CORT含量明显升高（P<0.05）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠血清CORT含量明显升高（P<0.01）。结果见图5。
注：与空白组比较，▲▲P<0.01；與模型组比较，▽P<0.05，
▽▽P<0.01；与百会+神门组比较，◇◇P<0.01
与百会+神门组比较，◇P<0.05；与百会+三阴交组比较，■■P<0.01
3 讨论
迄今为止，睡眠发生的确切机制尚未完全阐明。目前针灸治疗失眠症疗效显著，在临床上运用越来越广泛，备受研究者关注。百会，系督脉与手足三阳经之会穴，具有温养诸脏、安神健脑、镇惊熄风等作用。早在明代医著《针灸大成》就有“思虑劳伤心脾，灸百会”记载，可见百会对失眠症作用之大。某一脏腑或经脉发生病变时，遵循“不盛不虚，以经取之”的取穴原则，称为本经取穴。心主血脉，又主神明，为君主之官，是五脏六腑之大主，精神之所舍。心藏神，神在人体的生命活动中占有重要地位，睡眠作为人体重要的生理功能，也是由心神所主。神门为手少阴经之原穴，具有镇心安神之效，心神得安，则能入眠。三阴交为足太阴脾经腧穴，也是足三阴经交会穴，可通过调三阴经经气，使肝、脾、肾功能正常，从而使阴可敛阳，阴阳调和，则人可安然入睡。通过对历代古籍的研究发现，古代治疗失眠的针灸处方有156个，其中神门和三阴交是针灸治疗失眠最常用的主穴及配穴，且临床疗效显著[9]。故本实验将百会作为固定按部选穴，治疗各组再配以不同经脉选穴，分别为心经之神门和脾经之三阴交。神门为失眠症之本经穴，除本经外的其他正经统称为他经，本实验之三阴交则为他经穴。为说明经穴是否具有特异性，故另设一组“百会+非经非穴”作为对照组，使实验设计更为合理。
HPA轴功能紊乱是导致应激障碍发生的主要因素之一，是反映机体应激状态的中枢神经系统。下丘脑室旁核神经元分泌出CRH，CRH刺激神经垂体分泌ACTH，ACTH通过体循环到达肾上腺，促进肾上腺皮质释放CORT。以上3种激素在HPA轴上相互关联、相互影响，在HPA轴上CRH为上游调控激素，其合成和分泌能明显影响下游激素的合成和分泌。早在1967年，有学者发现失眠症患者较正常者CRH的分泌增多[10]。继而又有研究者发现，CRH水平与觉醒程度密切相关，外源性CRH可增加浅睡眠及觉醒，加快脑电波频率并减少慢波睡眠[11]。故CRH已成为增加睡眠脑电图频率从而促进觉醒公认的因素。单胺类神经递质ACTH具有提高大脑皮质应激性的作用，是睡眠觉醒调控机制中的重要环节[12]。CORT被称为“压力性激素”“应激性激素”，是目前公认的应激反应的经典指标，CORT水平升高影响机体物质吸收及新陈代谢，进而出现多梦易醒、心悸健忘、神疲食少、肢体倦怠、面色少华等失眠症状[13]。
PCPA造成的失眠模型是目前公认并广泛用于研究失眠与相关神经递质、激素及5-HT之间关系的经典动物模型。本实验采用PCPA混悬液造模方法并结合戊巴比妥钠睡眠实验对模型大鼠进行评价，结果提示造模成功。各针刺组大鼠经针刺后，下丘脑CRH含量及血清ACTH、CORT含量均有一定程度的降低，显示出一定改善睡眠的疗效，起到安神镇静的功能，表明针刺不同腧穴治疗失眠症的疗效确切，这与相关研究结果一致[14-15]，针刺改善睡眠的机制可通是过降低HPA轴相关激素水平实现的[16-17]。各针刺组间比较，针刺“神门”“三阴交”降低失眠大鼠下丘脑CRH水平的疗效相当，且二者作用均优于“非经非穴”，而针刺“神门”降低血清ACTH、CORT含量的作用优于三阴交及非经非穴，表明针刺“神门”治疗失眠症效果最优，针刺“三阴交”疗效次之。
综上所述，不同腧穴配伍方式，疗效也不相同，本实验通过固定取穴“百会”，再分别配以不同经脉腧穴（心经、脾经）及非经非穴，设计3个治疗组，对比本经穴、他经穴、非经非穴的疗效差异，按经选穴分组明显。根据本实验结果，神门可作为临床治疗失眠的必要穴位，三阴交可作为符合辨证的首选穴位。同时本实验结果表明，HPA轴相关激素水平可能是影响睡眠的机制之一，按经选穴针刺是腧穴配伍效应的影响因素之一。
参考文献：
[1] 肖成荣，马增春，李海静.PCPA失眠大鼠模型的制作及其机制[J].毒理学杂志，2007，21（4）：326.
[2] 全世建，林杏娥，刘妮.PCPA大鼠失眠模型的证候属性研究[J].中医药学刊，2006，24（3）：450-451.
[3] 肖爱娇，王河宝，刘海云.热敏灸对失眠大鼠模型血清内分泌激素水平的影响[J].江西中医学院学报，2013，25（4）：32-35.
[4] 顾思臻，窦丹波.中医中药对PCPA失眠大鼠模型HPA轴相关单胺类神经递质及激素影响的研究进展[J].上海中医药大学学报，2015，29（1）：83-86.
[5] 刘义，冯慧，刘文娟.针刺对原发性失眠症患者觉醒状态调节作用及其相关神经电生理学效应研究[J].中国针灸，2017，37（1）：19-23.endprint
[6] 李萍，岳增辉，谢涛.针灸治疗失眠的腧穴配伍研究概述[J].山东中医杂志，2015，34（11）：887-889.
[7] 冯浩.熟眠方对失眠模型大鼠下丘脑内5-HT（1a）、DRD2受体mRNA表达及5-HT、DA含量的影响[D].长春：长春中医药大学，2014.
[8] 郭义.实验针灸学[M].4版.北京：中国中医药出版社，2016：409-418.
[9] 于心同，何天峰，邴兴红，等.针灸治疗失眠临床用穴频次分析[J].针灸临床杂志，2012，28（6）：72.
[10] 王步青，王卫东.心率变异性分析方法的研究进展[J].北京生物医学工程，2007，26（5）：551-554.
[11] LATTOVA Z， KECKEIS M， MAUROVICH-HORVAT E， et al. The stress hormone system in various sleep disorders[J]. Psychiatric Research， 2011，45（9）：1223-1228.
[12] GERRA G， ZAIMOVIC A， ZAMBELLI U， et al. Neuroendocrine responses to psychological stress in adolescents with anxiety disorder[J]. Neuropsychobilogy，2000，42：82-89.
[13] 張书宁.自拟安神颗粒对心脾两虚型失眠症的临床研究[D].合肥：安徽中医药大学，2015.
[14] 周艳丽，高希言，王培育.针刺不同腧穴对失眠大鼠下丘脑γ-氨基丁酸和γ-氨基丁酸A受体的影响[J].针刺研究，2012，37（4）：302-307.
[15] 严兴科，张燕，于璐，等.“镇静安神”针法对心脾两虚型失眠患者匹兹堡睡眠指数的影响[J].针刺研究，2010，35（3）：222-225.
[16] 吴绮雯.电针神门、三阴交对心理应激失眠大鼠HPA轴功能的影响研究[D].成都：成都中医药大学，2014.
[17] 贾宝辉，李志刚，时宇静，等.电针对慢性应激模型大鼠行为学及HPA轴相关激素的影响[J].针刺研究，2004，29（4）：252-256.endprint
