...固一通 电法对胰岛素抵抗模型大鼠下丘脑irs 1蛋白及glut 4基因表达的...

刘霞+何军锋+屈娅婷+刘志君+蒲庆阳+郭胜童+杜佳+蒋鹏飞

摘要：目的 观察电针对饮食诱导的单纯性肥胖大鼠体质量、胰岛素抵抗及下丘脑刺鼠基因相关蛋白（AGRP）、神经肽Y（NPY）基因表达的影响，探讨电针治疗肥胖症的相关机制。方法 50只SD雄性大鼠随机分为低脂组10只和高脂组40只，高脂组大鼠造模成功后，随机分为模型组、电针组、西药组，每组10只。电针组电针“后三里”和“曲池”，每日1次，每次20 min，连续28 d；西药组予奥利司他灌胃，低脂组和模型组不做治疗。每日记录大鼠体质量，检测空腹血糖和胰岛素，RT-qPCR检测下丘脑AGRP和NPY基因表达水平，HE染色观察脂肪组织和肝脏形态。结果 治疗后电针组和西药组体质量、胰岛素抵抗指数、AGRP、NPY、脂肪细胞直径均低于模型组（P<0.05），2组比较差异无统计学意义。电针组和西药组肝脏脂变情况均得到改善。结论 电针通过改善胰岛素抵抗，抑制NPY和AGRP神经元的表达，达到控制体质量增长的目的。

关键词：电针；单纯性肥胖大鼠；体质量；胰岛素抵抗；刺鼠基因相关蛋白；神经肽Y；大鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0057-04

Effects of Electro-acupuncture on Insulin Resistance and Hypothalamic Agouti Gene-related Protein and Neuropeptide Y in Obesity Rats LIU Xia1， HE Jun-feng1，2，3， QU Ya-ting4， LIU Zhi-jun1， PU Qing-yang4， GUO Sheng-tong1， DU Jia1， JIANG Peng-fei1 （1. Institute of TCM Diagnostic， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Liuyang Hospital of Chinese Medicine， Liuyang City， Liuyang 410300， China； 3. Evidence Based Oriental Medicine， Sioux Falls 57106， USA； 4. Xiangxing College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To observe the effects of electro-acupuncture （EA） on body weight， insulin resistance， hypothalamic agouti gene-related protein （AGRP） and neuropeptide Y （NPY） in diet induced obesity （DIO） rats； To discuss its mechanism for DIO. Methods Fifty SD male rats were randomly divided into low fat diet groups （LFD） and high fat diet group. After the DIO models were established， the successful model rats were randomly divided into model group， EA group and Orlistat （OLST） group. EA was applied to “Zusanli” （ST36） and “Quchi” （LI11） for 20 minutes. The treatment was done once a day for 28 days. OLST was treated with orlistat by gavage. LFD and model did not receive treatment. Body weight was recorded every day. FPG and FINS were detected. The expressions of AGRP and NPY were detected by RT-QPCR. Morphological changes of adipocyte and liver were examined by HE staining. Results The body weight， HOMA-IR， AGRP， NPY and diameter of adipocyte of EA group and OLST group were significantly lower than model group （P<0.05）， difference between EA group and OLST group. The states of hepatic steatosis were improved in EA group and OLST group. Conclusion EA has the effects on weight loss by inhibiting the expressions of AGRP and NPY by improving IR.

Key words： electro-acupuncture； diet induced obesity rats； body weight； insulin resistance； agouti gene-related protein； neuropeptide Y； rats

基金项目：国家自然科学基金（81373717）；湖南省高校创新平台开放基金项目（12K084）；湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科开放基金项目（2013ZYZD13）

通讯作者：何军锋，E-mail：59421149@qq.com

肥胖症与糖尿病、高血压、高血脂等疾病密切相关，现已成为全球医学关注的热点。电针因安全无毒副反应等优点被广泛用于肥胖症的治疗，但其具体作用机制尚未完全明了。刺鼠基因相关蛋白（AGRP）和神经肽Y（NPY）是重要的食欲调节因子，有增强食欲、促进摄食的作用，胰岛素则可以作用于下丘脑而抑制食欲，促进产热，该作用主要通过AGRP/NPY介导[1]。本实验通过观察电针对饮食诱导的单纯性肥胖（DIO）大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）和下丘脑AGRP、NPY基因表达的影响，探讨电针治疗肥胖症的相关机制。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

SPF级4周龄SD大鼠50只，雄性，体质量约100 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号43004700012177。饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级实验室，控制室温为20～22 ℃，湿度30%～40%，自由饮水，昼夜交替12 h/12 h。低脂、高脂饲料，美国Research Diet公司。

1.2 药物

奥利司他胶囊，重庆植恩药业有限公司，批号20140412。

1.3 主要试剂与仪器

血糖试剂盒，罗氏公司，批号601404-01；125I胰岛素放射免疫分析试剂盒，北京北方生物技术研究所研制，批号201503；Trizol，美国 Invitrogen生命技术公司；SYBR Green qPCR Mix，日本TOYOBO公司；反转录试剂盒，Fermentas公司。华佗牌SDZ-V电针仪，苏州医疗用品厂有限公司；华佗牌无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司，0.25 mm×13 mm；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂；7300荧光定量PCR仪，美国ABI；RM2235轮转石蜡切片机，德国徕卡。

2 实验方法

2.1 造模

实验大鼠适应性喂养1周后，随机分为低脂组10只和高脂组40只，分别喂饲低脂和高脂饲料。以高脂组大鼠体质量超过低脂组大鼠平均体质量20%为成模标准。

2.2 分组及治疗

将造模成功的DIO大鼠30只随机分为3组，一组不做任何治疗为模型组，一组予以电针治疗为电针组，一组予以奥利司他灌胃为西药组，每组10只。将电针组大鼠放入自制固定器中，根据《实验针灸学》[2]常用实验动物针灸穴位定位，取双侧“后三里”和“曲池”，一次性使用无菌针灸针分别刺入7 mm和4 mm，然后接通电针仪，采用频率10 Hz、强度1.5 mA、连续波，每次治疗20 min，每日1次，连续28 d。西药组予奥利司他灌胃，成人每日临床用量为360 mg/d，按体表面积等效剂量换算比率，大鼠按1 mL/100 g计算灌胃量，每日灌胃1次，连续28 d。低脂组和模型组不予任何治疗。治疗期间，为保证实验前后可比性，低脂组予低脂饲料喂养，模型组、电针组和西药组仍予高脂饲料喂养。每日观察记录各组大鼠体质量、摄食饮水量、大小便情况等。

2.3 取材

28 d后，各组大鼠禁食过夜，次日予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000 r/min离心10 min，分离血清待测。取肾周脂肪、肝脏右外叶，10%福尔马林固定。在冰上迅速取出下丘脑，置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。

2.4 指标检测

2.4.1 生化指标检测 应用血糖试剂盒和125I胰岛素放射免疫分析试剂盒分别检测FPG和FINS含量。

2.4.2 病理观察 HE染色，经脱水透明、浸蜡包埋、切片和贴片、脱蜡染色、脱水透明和中性树胶封固等，镜下观察脂肪组织和肝脏标本并拍照。

2.4.3 RT-qPCR检测 ①引物设计。从NCBI中下载基因序列，引物设计采用Primer 5.0软件，引物序列分别为：NPY f- GTGTTTGGGCATTCTGGCTG，NPY r-GTGGGACAGGCAGACTGGTT，引物长度320 bp；AGRP f-TAGGCAAGGATCAACAAGCAA，AGRP r- TAGACCTGAGAACTCTGGGAA，引物长度161 bp；β-actin f-CCCATCTATGAGGGTTACGC，β-actin r- TTTAATGTCACGCACGATTTC，引物长度118 bp。②总RNA提取：每100 mg下丘脑标本加入1 mL Trizol液氮研磨，根据试剂盒提取样品总RNA，并测定RNA的纯度和浓度。③cDNA第一链的合成。0.5 ?L OligodT（0.5 ?g/?L）和5.5 ?L Total RNA加入PCR小管中，补充DEPC处理水至12 ?L；混匀后离心，65 ℃温浴5 min，立即置于冰上。按比例配制反应体系（冰上进行）：5×Reaction Buffer 2 ?L，RNase Inhibitor 0.5 ?L，10 mmol/L dNTPs 1 ?L，Reverse Transcriptase 0.5 ?L，混匀，短暂离心。上述体系在42 ℃反应1 h，然后在70 ℃水浴锅中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活；将得到cDNA 置于-20 ℃保存备用。④RT-qPCR。按比例配制反应体系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 ?L，上游引物（10 ?mol/L）1 ?L；下游引物（10 ?mol/L）1 ?L，cDNA 1 ?L，水7.0 ?L。设定程序为两步法Real-Time定量，预变性95 ℃、3 min，之后每一步变性95 ℃、10 s，58 ℃退火延伸30 s，共35个循环，每次在延伸阶段读取荧光值。用2-ΔΔCt法进行各基因表达的相对定量。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐用LSD分析，方差不齐用Dunnett T3分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 电针对模型大鼠体质量的影响

造模前各组大鼠体质量无差异。造模后，模型组、西药组及电针组体质量明显高于低脂组（P<0.05）。治疗4周后，西药组和电针组大鼠体质量明显低于模型组（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

4.2 电针对模型大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数的影响

电针组FINS、FPG明显低于模型组（P<0.05）；电针组和西药组胰岛素抵抗指数（HOMA-IR=FINS×FPG÷22.5）明显低于模型组（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

4.3 电针对模型大鼠下丘脑刺鼠基因相关蛋白、神经肽Y基因表达的影响

与低脂组比较，模型组AGRP、NPY基因表达水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，西药组和电针组AGRP、NPY基因表达水平明显下降（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

4.4 电针对模型大鼠脂肪细胞、肝脏组织的影响

模型组大鼠脂肪细胞直径大于低脂组（P<0.05），而西药组和电针组脂肪细胞直径小于模型组（P<0.05），见表4、图1。光镜下，低脂组大鼠肝脏可见单个脂变肝细胞；模型组大鼠肝细胞体积增大，胞浆内脂滴大小不一，脂变细胞达3/4以上，细胞水肿严重，灶性炎细胞浸润；西药组和电针组较模型组脂变细胞在1/2以下，胞浆内脂滴变小，轻度水肿，无炎细胞浸润。各组大鼠肝脏病理变化见图2。

4.5 不良反应

西药组大鼠大便溏稀不成形，活动减少，精神萎靡，毛色枯黄；模型组大鼠大便尚可，活动量稍减少，毛色略黄；电针组和低脂组大便正常，毛色有光泽。

5 讨论

对于单纯性肥胖症的治疗，目前主要有药物疗法、针灸疗法、手术疗法和运动疗法等。自从曲美等一批盐酸西布曲明类药物下架后，奥利司他是目前国内仅有的合法减肥药。该药可抑制胃肠道消化脂肪所需的酵素，而减少胃肠道对脂肪的吸收，但易导致脂肪代谢紊乱，表现为胃肠胀气、大便次数增多和脂肪便等[3]。在本实验中，我们亦观察到西药组大鼠大便溏稀不成形、体毛枯黄，而电针组大鼠大便正常，毛色有光泽。

阳明经为多气多血之经脉，与能量代谢关系最为密切，食欲的强弱直接与胃经和胃气相关，无论是临床实践还是动物模型操作中，阳明经腧穴常被选为针刺干预肥胖的主穴。因此本实验中，我们选择阳明经的“后三里”和“曲池”作为治疗肥胖大鼠的腧穴。

在本实验中，电针组和西药组治疗4周后，体质量明显低于模型组（P<0.05），治疗期间体质量增长数值亦低于模型组（P<0.05），表明电针和奥利司他均可有效抑制DIO大鼠体质量的增长。

胰岛素是重要的能量调节因子，正常大鼠予下丘脑注射胰岛素可明显抑制摄食。下丘脑在食欲调节及摄食中起着关键作用，其中的弓状核含有许多调节食欲的神经肽，包括促进摄食的AGRP和NPY。弓状核上的AGRP和NPY神经元含有胰岛素受体。下丘脑的胰岛素通过与其受体结合后，启动相关转导信号，可以抑制AGRP和NPY神经元的表达[4]，达到降低食欲，增加产热和能量消耗的作用。然而流行病学调查表明，肥胖者存在着明显的胰岛素抵抗[5]，高胰岛素血症是胰岛素抵抗的一个主要标志[6]。肥胖者体内虽然存在着较高水平的胰岛素，却无法发挥其相应的作用。

研究表明，减轻糖尿病患者的体质量能有效改善胰岛素抵抗、降低血糖[7]。我们在实验中也观察到，模型组胰岛素水平较低脂组升高，提示模型组大鼠可能存在胰岛素抵抗。而电针治疗4周后，电针组大鼠胰岛素水平较模型组显著下降（P<0.05），相应的HOMA-IR亦显著下降（P<0.05），说明电针组大鼠的胰岛素抵抗情况得到明显改善。同时，我们观察到，模型组AGRP和NPY基因表达水平显著高于低脂组（P<0.05），而电针组其基因表达水平均显著低于模型组（P<0.05）。提示电针组大鼠治疗后胰岛素抵抗的状况得到改善，增加了胰岛素的敏感性，通过与其受体结合，抑制了AGRP和NPY神经元的表达。

脂肪细胞体积增大是肥胖症的重要组织学特征。模型组大鼠脂肪体积增大，这与人类肥胖症的组织学改变相一致。治疗4周后，电针组和西药组大鼠脂肪细胞直径明显变小，表明整体的脂肪代谢经调整后，脂肪组织结构发生了相应的改变，可能是其减肥的重要形态学基础。病理观察结果显示，电针组和西药组大鼠肝组织脂肪病变较模型组明显减轻，表明2组皆可改善肝脏中脂质的含量。

本研究结果表明，电针可通过改善胰岛素抵抗情况，从而抑制促食因子AGRP和NPY神经元的基因表达，同时改变脂肪细胞大小、改善肝脏脂变状态，而达到控制体质量增长的目的。电针对胰岛素及下丘脑NPY和AGRP基因表达的良性调整作用可能是电针减肥的重要细胞分子作用机制。相较西药组大鼠表现出来的不良反应，电针是一种具有明显优势的抗肥胖治疗方法。

参考文献：

[1] MAYER C M， BELSHAM D D. Insulin directly regulates NPY and AgRP gene expression via the MAPK MEK/ERK signal transduction pathway in mHypoE-46 hypothalamic neurons[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2009，307（1/2）：99-108.

[2] 余曙光，郭义.实验针灸学[M].上海：上海科学技术出版社，2009：150- 151.

[3] 马微，付丽，王海波，等.新型减肥药奥利司他的研究进展[J].华西药学杂志，2009，24（4）：431-433.

[4] BECK B. Neuropeptides and obesity[J]. Nutrition，2000，16（10）：916-923.

[5] BLOOMGARDEN Z T. Insulin resistance concepts[J]. Diabetes Care， 2007，30（5）：1320-1326.

[6] 潘时中.胰岛素抵抗综合征的处理[J].高血压杂志，2000，8（2）：185-186.

[7] 夏欣，陈建峰，江海丽，等.对肥胖型2型糖尿病患者体重控制的中西医治疗[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（11）：73-76.