不同产地五味子药材色谱谱研究..doc
王连芝+付克+顾媛媛+刘磊+张淑香+周琦
摘要：目的 采用高效液相色谱法建立五味子药材的指纹图谱研究方法，并对不同产地五味子指纹图谱进行相似度分析。方法 采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm。结果 建立了五味子药材的高效液相色谱指纹图谱研究方法，确定了指纹图谱中29个共有峰，各产地药材指纹图谱的相似度均在0.95以上。结论 本方法简便易行，可为评价五味子质量提供依据。
关键词：五味子；指纹图谱；高效液相色谱法；质量控制
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0103-04
Abstract： Objective To establish the fingerprint analysis method of Schisandrae Chinensis Fructus by HPLC； To analyze the similarity on the fingerprints of Schisandrae Chinensis Fructus from different producing areas. Methods The chromatographic separation was performed by HPLC on a Diamonsil C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 ?m）. Acetonitrile-water was used as gradient mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was maintained at 30 ℃. The detection wavelength was set at 254 nm. Results The HPLC fingerprint analysis method of Schisandrae Chinensis Fructus was established. Twenty-nine common fingerprint peaks were identified. The similarities of the fingerprints of ten samples from different producing areas were above 0.95. Conclusion The method is simple and reliable， which can provide a scientific basis for quality evaluation of Schisandrae Chinensis Fructus.
Key words： Schisandrae Chinensis Fructus； fingerprint； HPLC； quality control
五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，其味酸、甘，性温，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等[1]。作为传统中药材，五味子应用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，记载曰：“本品益气、咳逆上气，劳伤羸瘦、补不足，强阴，益男子精。”五味子中含有多种化学成分，如木脂素、多糖、挥发油、有机酸、三萜、甾醇、香豆素、内酯、蛋白质、氨基酸、生物碱类、黄酮类、强心苷类等[2-4]。其中，木脂素是其主要化学成分[5-6]。本试验采用HPLC对东北地区10个不同产地五味子药材进行指纹图谱分析，为完善五味子的质量评价提供依据。
1 仪器与试药
Waters2695-2998型高效液相色谱仪（Waters公司），KQ-300VD型双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA1104型电子分析天平（上海精胜科学仪器有限公司）。
五味子醇甲对照品（110857-201412）、五味子酯甲对照品（111529-200604）、五味子甲素对照品（110764-201111）、五味子乙素对照品（110765- 201311），中国食品药品检定研究院；五味子醇乙对照品（批号130509）、五味子丙素对照品（批号130521），成都标样生物科技有限公司，纯度≥98%；五味子对照药材，上海标准物质研究中心；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。五味子药材经黑龙江中医药大学付克研究员鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，样品来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱温：35 ℃；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0～17 min，50%乙腈；17～25 min，50%～55%乙腈；25～30 min，55%～75%乙腈；30～40 min，75%～65%乙腈，40～45 min，65%乙腈；45～55 min，65%～100%乙腈；55～65 min，100%乙腈）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 ?L。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素对照品，加甲醇适量，制成五味子对照品溶液。
2.3 供试品溶液及对照药材溶液的制备
取药材细粉0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理（功率600 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即为供试品溶液。同法制得对照药材溶液。
2.4 指纹图谱的绘制
分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10 ?L，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，制得HPLC指纹图谱。色谱图见图1。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取1号样品1份，制备供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱峰，结果各共有峰相对保留时间RSD<1.5%，相对峰面积RSD<3%，表明仪器的精密度良好。
2.5.2 重复性试验 取1号样品6份，制备供试品溶液，依次检测指纹图谱峰，各共有峰相对保留时间RSD<3%，相对峰面积RSD<3%，表明本方法的重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20 h检测，各共有峰相对保留时间RSD<3%，相对峰面积RSD<3%，表明供试品溶液在20 h内稳定。
2.6 共有峰的确定及色谱峰的标定
对不同产地药材供试品的指纹图谱进行分析，确定了29个共有指纹峰。通过比较供试品色谱图与对照品色谱图的保留时间和紫外光谱检测结果，对共有指纹峰进行标定，确认了6个主要的木脂素指纹峰。其中，供试品图谱中保留时间为13.411 min处的色谱峰为五味子醇甲对照品色谱峰，保留时间为31.343 min处的色谱峰为五味子醇乙对照品的色谱峰，保留时间为27.0 min处的色谱峰为五味子酯甲对照品的色谱峰，保留时间为38.076 min处的色谱峰为五味子甲素对照品的色谱峰，保留时间为44.535 min处的色谱峰为五味子乙素对照品色谱峰，保留时间为49.748 min处的色谱峰为五味子丙素对照品的色谱峰。
2.7 指纹图谱相似度评价
利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723）软件对不同产地五味子的指纹图谱进行相似度分析。以五味子标准药材指纹图谱作为参照图谱，时间窗宽度选择0.1，并进行多点校正，生成五味子对照指纹图谱，选定上述29个共有峰进行谱峰自动匹配，匹配结果见表2。并对五味子药材进行相似度计算，结果见表3。
3 讨论
本研究相似度计算结果显示，各产地药材相似度较高，相似度评价结果均在0.95以上，说明10批五味子药材的质量差别不明显。其中，S1、S5、S6、S8和S9这5个产地的药材相似程度最高，相似度均在99%左右。S1、S6、S8和S9均为栽培品种，说明五味子的栽培品种质量更稳定。由此可以看出，本课题所研究的HPLC特征指纹图谱能够反映五味子药材的固有属性，结合相似度分析，可以用于不同产地五味子药材的辨别，为五味子药材的质量控制提供了系统、有效的参考方法。
参考文献：
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