多叶棘豆体外抗菌作用部位的筛选研究-啊啊,峯叶情是加拿大啊?真远啊 远得很,要坐十一个多小时的飞机...

孟根小++奥?乌力吉++霍万学++王秀兰++王欢

摘要：目的 对比研究多叶棘豆不同提取物对临床常见6种致病菌体外抗菌作用，筛选抗菌活性部位，初步判断药效物质种类。方法 以多叶棘豆不同溶剂（石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇）提取物为试验药物，采用微孔板二倍稀释TTC法和琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），液体转染法测定最小杀菌浓度（MBC）。采用分光光度法测定总黄酮含量。结果 多叶棘豆5种提取物均有体外抗菌作用，其中乙酸乙酯提取物抗菌作用最强，对最敏感菌（金黄色葡萄球菌）的MIC和MBC分别为0.02 mg/mL和1.25 mg/mL；其次为正丁醇提取物和石油醚提取物；剩余物的作用最弱。各提取物的总黄酮含量大小与抗菌活性强弱顺序一致，即乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>剩余物。结论 多叶棘豆体外抗菌作用与黄酮类成分密切相关。

关键词：多叶棘豆；提取物；体外抗菌；作用部位

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.013

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0051-04

Study on Screening for Antibacterial Active Site of Oxytropis Myriophylla in Vitro MENG Gen-xiao1，2， AO Wuliji2， HUO Wan-xue2， WANG Xiu-lan2， WANG Huan2 （1. College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 100193， China； 2. College of Traditional Mongolian Medicine， Inner Mongolia University for the Nationalities， Tongliao 028300， China）

Abstract： Objective To compare the antibacterial activity of the different extracts from Oxytropis Myriophylla against 6 common pathogens in vitro； To select the best active site of Oxytropis Myriophylla with antibacterial activity； To preliminarily determine the material basis for efficacy category. Methods 4 different solvent （petroleum ether， dichloromethane， ethyl acetate and normal butanol） extracts of Oxytropis Myriophylla were selected as experimental medicine. MIC was determined by microtiter plate double dilution TTC method and agar disk dilution method. MBC were tested by liquid infection method. Spectrophotometric method was adopted to determine the contents of total flavonoid in the samples. Results All extracts had the antibacterial activity in vitro. But the ethyl acetate extract was the best one that MIC and MBC against one the most sensitive pathogen （Staph. aureus） were 0.02 mg/mL and 1.25mg/mL. Followed by normal butanol extract and petroleum ether extract， the remainder had the lowest activity. Total flavonoid contents of the extracts were exactly the same order with antibacterial effects of them：that ethyl acetate extract > normal butanol extract > petroleum ether extract > dichloromethane extract > remainder. Conclusion The antibacterial activity of Oxytropis Myriophylla is closely related to flavonoid.

Key words： Oxytropis Myriophylla； solvent extracts； antibacterial activity in vitro； active site

多叶棘豆为豆科植物狐尾藻棘豆Oxytropis myriophylla（Pall.）DC.的干燥地上部分，蒙药名为“那布其热哈格·乌如吐扎”，是蒙医常用杀“粘”药物之一，具有杀粘、清热、燥黄水、愈伤、生肌、合脉止

基金项目：国家科技支撑计划（2012BA128B00）

血、消肿、软便的功效[1-2]。多叶棘豆含有黄酮类[3-4]、木酚素类[5]、三萜皂苷[6]和生物碱类[7]等多种成分。因此，化学成分的探讨成为该药材的研究热点。但关于杀“粘”作用，只有对白假丝酵母和大肠杆菌的抗菌研究[8-9]。为了进一步评价多叶棘豆的杀“粘”作用、筛选最佳活性部位，本实验研究该药不同提取物对临床常见6种致病菌的体外抗菌作用，并基于笔者从该药提取的化合物多为黄酮类[3]，测定各部位的总黄酮含量，初步判断抑菌活性物质。

1 实验材料

1.1 药物

多叶棘豆2014年7月采自内蒙古通辽市罕山自然保护区，经内蒙古民族大学蒙医药学院布和巴特尔教授鉴定为豆科棘豆属植物狐尾藻棘豆Oxytropis myriophylla（Pall.）DC.的干燥地上部分。

1.2 菌种

金黄色葡糖球菌（CNCC38-C57-7）、变形杆菌（49023-2）、大肠埃希菌（44822-2）、铜绿假单胞菌（CV CC3359 Pa.1）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和乙型副伤寒杆菌（50004），中国食品药品检定研究院，用MH肉汤稀释为105、107 CFU/mL菌液。

1.3 主要试剂与仪器

芦丁（博美生物科技有限公司，批号Lc18211），苯扎溴铵溶液（山东利尔康科技股份有限公司），MH肉汤培养基（上海信裕生物科技有限公司），石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、二甲基亚砜、硝酸铝、亚硝酸钠和氢氧化钠等试剂均为分析纯。MJ-78高压灭菌器（施都凯仪器设备有限责任公司），DK-600S水浴箱（上海精宏实验设备有限公司），生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），酶标仪（Multiscan MK3），DL-ZD1细菌比浊仪（珠海迪尔公司），CO2培养箱（FORMA STERI-CYCLE CO2 Incubator），DHG-9076 A干烤箱（上海精宏实验设备有限公司），UV-2501紫外-可见分光光度计（日本岛津），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂），ISO9001电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），RE-2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

干燥多叶棘豆粉末（过100目筛）363 g加95%乙醇4 L回流提取3 h，过滤。药渣再用95%乙醇2 L提取2次，过滤，合并滤液。滤液减压回收乙醇得浸膏48 g。浸膏加适量水成悬浮液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取数次至无色，合并提取液，减压回收提取溶剂，得石油醚提取物10.5 g、二氯甲烷提取物8.3 g、乙酸乙酯提取物2.7 g、正丁醇提取物10.9 g和提取剩余物15.6 g。分别精密称取上述提取物0.2 g，依次加入10 mL二甲基亚砜完全溶解，配制5种提取物的供试液，浓度均为20.0 mg/mL。100 ℃真空高压灭菌20 min，备用。

2.2 微孔板二倍稀释TTC法测定最低抑菌浓度

经消毒的96孔培养板各孔中，用微量移液器加MH肉汤培养基100 ?L。在每排第1孔中再加100 ?L药液，混合。吸取100 ?L混合液移入第2孔，以此类推至第10孔后，弃去100 ?L混合液。第11孔（阳性对照组）和第12孔（阴性对照组）中加0.30 ?g/?L苯扎溴铵溶液和二甲基亚砜各100 ?L，混合，弃去100 ?L混合液。每孔加入105 CFU/mL菌液100 ?L和5 ?L 0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液。微孔板置荡器上震荡1 min，盖胶膜密封，放湿盘内35 ℃培养16～24 h，观察。

采用目测法和酶标仪法判断结果。前者，对比药物组和阳性对照组的颜色，两者颜色相同的最高稀释度即为该药最低抑菌浓度（MIC）。后者，于酶标仪波长450 nm处检测样品OD值。等于或接近阳性对照组OD值的最高稀释度为MIC。如有高浓度有色样品排除干扰，即连续3个试验孔OD值顺序递增，且最高稀释度孔（第3孔）OD值比阴性对照组OD值减少0.25以上时，以第2个孔的稀释度为MIC。

2.3 琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度

将5种多叶棘豆供试药原液用无菌生理盐水配制成1/2、1/4、1/8、1/16…1/256倍稀释药液，分别精密吸取倍稀释药液1 mL置于6 cm直径无菌平皿，与9 mL MH琼脂混合制备成含不同浓度药液的平板，设2个复孔。待琼脂平板凝固后，按照事先绘制的模板位置，在平皿底面对应区域做好菌名标记。用微量加样器吸取1×107 CFU/mL菌液2 μL，在每个对应位置将菌液涂布成直径5～8 mmol/L的圆点。变形杆菌单独接种在一个平皿上，其余5种菌接种于同一个平皿上。35 ℃培养16～20 h，观察。完全抑制菌落生长的最低药物浓度为该药对供试菌的MIC。

2.4 最小杀菌浓度的测定

采用液体转染法。根据微孔板二倍稀释TTC法测定结果，分别吸取MIC以上未见细菌生长的各微孔培养物0.1 mL，移种在不含药物的MH琼脂培养基上，35 ℃孵育24 h，仍无细菌生长的最高稀释浓度为最小杀菌浓度（MBC）。

2.5 分光光度法测定各提取物中的总黄酮含量

分别精密称取多叶棘豆5种提取物0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%乙醇20 mL，称重，超声30 min，用70%乙醇补足缺失质量，过滤，取滤液得5种提取物溶液。精密吸取上述各溶液2 mL，分别加入50 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠20 mL，摇匀，放置20 min。以阴性对照液（不加样品）为参比，用分光光度计510 nm波长处测定吸光度，计算样品总黄酮含量。参照文献[10-11]方法进行线性关系、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收试验等方法学考察。

3 结果

3.1 多叶棘豆不同溶剂提取物的最低抑菌浓度

多叶棘豆不同溶剂提取物对6种临床致病菌均有抑菌效果，其中，对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，MIC为0.02 mg/mL，其次对大肠埃希菌和乙型伤寒杆菌的MIC均为1.25 mg/mL。综合微孔板TTC法和琼脂平板稀释法检测结果见表1、表2。虽然2种方法测得MIC有所差异，但是抑菌效果最好的均为乙酸乙酯提取物，其对6种致病菌的MIC范围为0.02～2.50 mg/mL。正丁醇提取物和石油醚提取物抑制4种临床致病菌，MIC范围为0.31～2.50 mg/mL，二氯甲烷提取物抑制2种致病菌，剩余物只抑制金黄色葡萄球菌。

3.2 多叶棘豆不同溶剂提取物的最小杀菌浓度

多叶棘豆不同溶剂提取物对6种临床致病菌MBC结果见表3。除剩余物外，其他提取物对金黄色葡萄球菌和变形杆菌均有杀菌作用，MBC范围为1.25～5.00 mg/mL和2.50～5.00 mg/mL。但在本实验浓度下，不同溶剂提取物中只有乙酸乙酯提取物对6种致病菌均有杀菌效果，MBC范围为1.25～5.00 mg/mL。正丁醇和石油醚提取物对4种致病菌有杀菌作用，MBC范围为2.50～5.00 mg/mL。剩余物无杀菌作用。

3.3 多叶棘豆不同溶剂提取物总黄酮含量比较

测定6个不同浓度的芦丁标准溶液在510 nm波长处的吸光度，并以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，计算回归方程得Y=0.109X-0.118，r2=0.999 5，线性范围7.982 1～64.105 7 ?g/mL。方法学考察结果：精密度试验、重复性试验和稳定性试验所得样品吸光度的RSD分别为1.23%、1.05%和1.72%；平均加样回收率=104.8%，RSD=2.01%。

使用回归方程计算多叶棘豆不同提取物的总黄酮含量见图1。其中乙酸乙酯提取物总黄酮含量最高，为16.70%；其次为正丁醇提取物总黄酮含量为11.62%；剩余物总黄酮含量最低，为4.57%。

4 讨论

根据“粘”为“肉眼看不到的致病虫”的蒙医理论[1]，人体各种致病微生物均属于“粘”。作为蒙医常用杀“粘”药物之一，多叶棘豆对临床常见6种致病菌均有体外抗菌作用。尤其对金黄色葡萄球菌作用最强，各提取物MIC和MBC范围为0.02～5.00 mg/mL和1.25～5.00 mg/mL。然而不同提取物对各种致病菌的抑制作用有所差异。其中，乙酸乙酯提取物对6种致病菌均有杀菌作用，正丁醇和石油醚提取物杀菌4种；二氯甲烷提取物仅抑制金黄色葡萄球菌和变形杆菌，剩余物在本实验浓度下无杀菌作用。因此，多叶棘豆抗菌活性物质的筛选部位首选乙酸乙酯提取物。由于多叶棘豆含有丰富的黄酮类物质，总黄酮含量测定结果表明，各提取物总黄酮含量大小与其抗菌活性强弱完全一致，即乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>剩余物。进一步说明，多叶棘豆体外抗菌作用与黄酮类成分有关；乙酸乙酯提取物对6种致病菌较强的杀菌作用与其高含量的黄酮类成分密不可分。但是，多叶棘豆的化学成分多样复杂，抗菌作用可能并非只取决于黄酮类成分，有待进一步深入研究。

本研究采用微孔板二倍稀释法和琼脂平板稀释法测定MIC，2种方法互为验证，意在获得较为确切的实验数据，2种实验方法测得的MIC数据具有较好的一致性。但2种实验方法中，相同药物提取物对少数菌的作用出现不同的结果，其原因除了实验条件的控制因素外，首先可能与不同的细菌在液体和固体2种培养基中生长活力不同有关，其次可能与药物在2种培养基中保持和发挥活性的状态不同有关。这种现象在本实验MBC测定中同样有所表现。

综上，本实验通过活性部位筛选研究多叶棘豆的抗菌作用，为该药杀“粘”活性物质的提取分离提供了实验依据。

参考文献：

[1] 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书：蒙医学[M].上海：上海科学技术出版社，1993：212.

[2] 罗布桑.蒙药学[M].呼和浩特：内蒙古民族出版社，2006：196.

[3] 孟根小，王青虎，郭玉海，等.蒙药多叶棘豆中的黄酮类化学成分[J].天然产物研究与开发，2014，26（10）：1614-1617.

[4] LU J H， LIU Y， ZHAO Y Y， et al. New flavonoids from Oxytropis myriophylla[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2004，52（2）：276-278.

[5] SHE G M， SUN F F， LIU Bin. A new lignan from Oxytropis myriophylla[J]. Natural Product Research，2012，26（14）：1285- 1290.

[6] OKAWA M， YAMAGUCHI R， DELGER H， et al. Five triterpene glycosides from Oxytropis myriophylla[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2002，50（8）：1097-1099.

[7] KOJJMA K， PUREVSUREN S， NARANTUYA S， et al. Alkaloids from Oxytropis myriophylla （Pall） DC[J]. Scientia Pharmaceutica， 2001，69（4）：383-388.

[8] 姚媛媛.致犊牛腹泻病肠道大肠杆菌的分离鉴定及蒙药复方对其抗菌效果研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.

[9] 霍万学.蒙医杀“粘”方剂药物抗真菌的实验研究[D].长春：吉林大学，2011.

[10] 巴根那，白玉霞，布日额，等.正交设计研究蒙药多叶棘豆总黄酮提取工艺[J].内蒙古民族大学学报，2001，16（1）：77-80.

[11] 陶贵斌，赵晶丽，郭悦，等.马齿苋总黄酮提取工艺研究[J].长春中医药大学学报，2014，30（5）：808-809.

（收稿日期：2016-01-29）

（修回日期：2016-03-21；编辑：华强）