...对肺间质纤维化大鼠治疗作用的实验研究.pdf
吴芊+崔人匀+托托+肖伊+黄羚+刘豫玥+刘锦林+牟天龙+潘彦舒
摘要：目的 基于“异病同治”理论探讨锡类散栓剂对大鼠宫颈炎的治疗作用。方法 采用阴道灌注苯酚胶浆制作大鼠宫颈炎模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和锡类散低、中、高剂量组。造模结束后次日锡类散栓剂阴道给药，连续10 d，血常规分析仪检测大鼠血液中性粒细胞数和白细胞总数，HE染色行宫颈病理组织学检查。结果 与正常组比较，模型组中性粒细胞数和白细胞总数显著升高（P<0.01）。与模型组比较，锡类散低剂量组血液中性粒细胞数、白细胞总数显著降低（P<0.05，P<0.01），大鼠宫颈黏膜上皮炎症及组织损伤均明显减轻；锡类散中剂量组血液中性粒细胞数有降低趋势（P>0.05），白细胞总数无明显变化；锡类散高剂量组血液中性粒细胞数显著升高（P<0.01），白细胞总数有升高趋势（P>0.05）；阳性药组血液中性粒细胞数和白细胞总数显著降低（P<0.01），大鼠宫颈黏膜上皮炎症及组织损伤均明显减轻。结论 锡类散可减轻大鼠宫颈炎症损伤，修复受损宫颈黏膜，具有异病同治的作用。
关键词：锡类散；栓剂；宫颈炎；异病同治；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0082-05
Experimental Study on Therapeutic Effects of Xileisan Pessary on Rats with Cervicitis WU Qian1， CUI Ren-yun1， TUO Tuo1， XIAO Yi1， HUANG Ling1， LIU Yu-yue2， LIU Jin-lin1， MU Tian-long2， PAN Yan-shu3 （1. Basic Medical College， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2. East Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China； 3. Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
Abstract： Objective To study the therapeutic effects of Xileisan Pessary on rats with cervicitis based on the idea of treating different diseases with the same therapy. Methods Vagina perfusion of hydroxybenzene mucilage was used to establish rat cervicitis models. Rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， low-， medium-， and high-dose Xileisan Pessary groups. Rats with cervicitis were treated with Xileisan Pessary from the next day after modeling for 10 days. The amount of neutrophilic granulocytes and leukocytes were detected by blood routine analysis meter； cervial histopathologic examination was conducted by HE staining. Results Compared with normal group， the numbers of granulocyte and leucocyte increased significantly in the model group （P<0.01）. Compared with the model group， the numbers of granulocyte and leucocyte in the low-dose Xileisan Pessary group showed a decreasing trend （P<0.05， P<0.01）； cervical inflammation mucosal epithelium and tissue necrosis were signally alleviated； granulocyte in the medium-dose Xileisan Pessary group showed a decreasing trend （P>0.05）； the content of leucocyte hardly changed； granulocyte in the high-dose Xileisan Pessary group increased observably （P<0.01）； the number of leucocyte showed an increasing trend （P>0.05）， and the numbers of granulocyte and leucocyte in positive medicine group decreased observably （P<0.01）， and cervical inflammation mucosal epithelium and tissue necrosis were also signally alleviated. Conclusion Xileisan Perssary can relieve the inflammation of cervix and repair injured mucosa. It has the function of treating different diseases with the same therapy.
Key words： Xileisan； perssary； cervicitis； treating different diseases with the same therapy； rats
基金项目：教育部大学生创新性实验计划项目（201410026008）
通讯作者：潘彦舒，E-mail：13911209998@163.com
锡类散源于清·尤在泾《金匮翼·卷五》中的烂喉痧方，由象牙屑、牛黄、青黛、冰片等7味药组成，主治咽喉红肿糜烂、唇舌肿痛等症。口腔溃疡的中医病机是湿热火毒上炎、气血郁滞、血瘀肉腐，同为以黏膜损伤为主要病变的宫颈炎属中医学“带下病”范畴，多因湿热毒邪下侵、气血郁滞、血瘀肉腐而成。从中医学理论角度阐释口腔溃疡与宫颈炎病机具有一些共同特点，均为湿毒热毒侵袭、气血郁滞、血瘀肉腐所致。因此，我们根据“异病同治”的辨证思想，结合上述理论探索及文献研究，提出如下假说：锡类散对宫颈炎同样可能发挥抗炎作用，能够加速修复宫颈黏膜，可以运用于宫颈炎的治疗。此外，为使药物更适合临床使用，将锡类散传统粉剂创新性地改良为栓剂，采用阴道灌注苯酚胶浆制作大鼠宫颈炎模型，观察其对大鼠宫颈炎治疗作用。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级SD雌性大鼠75只，体质量170～240 g，7～12周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于清洁级动物房，室温23～25 ℃，相对湿度50%～70%。
1.2 药物及制备
锡类散，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号1309412；半合成脂肪酸酯，上海雷虹工贸有限公司，批号140801；聚甲酚磺醛栓，湖北东信药业有限公司，批号20140610。实验用栓制备：参照《中药药剂学》[1]进行重量转换，按照栓剂制作法中热熔法，选取半合成脂肪酸酯作为基质，置于发皿中水浴加热，待2/3基质熔化时停止加热，搅拌使全熔；称取锡类散分次加入熔化的基质中，不断搅拌使药物均匀分散，待此混合物呈黏稠状态时，灌入已涂有润滑剂的实验动物硅胶栓剂模具内，冷却凝固后削去模口上溢出部分，脱模，制成黄豆大小的鸭嘴形栓剂备用。实验用栓分为低剂量药栓（锡类散含量0.17 mg/粒）、中剂量药栓（锡类散含量0.34 mg/粒）、高剂量药栓（锡类散含量0.68 mg/粒）、基质栓（无药物）和阳性对照药物栓（聚甲酚磺醛含量0.45 mg/粒），规格0.3 g/粒。
1.3 试剂
水合三氯乙醛，国药集团化学试剂有限公司；医用生理盐水，大冢制药有限公司；阿拉伯树胶粉，天津市福晨化学试剂厂；苯酚，Amresco；二甲苯，北京化工厂；无水乙醇，北京化工厂；苏木素，中杉金桥；伊红，Coolaber；氨水，Biotopped；25%苯酚胶浆（精密称取苯酚1.25 g、阿拉伯树胶粉3.75 g，溶于蒸馏水5 mL中制成胶浆）。
1.4 仪器
XI-800型全自动血液分析仪，希斯美康公司；R320型台式冷冻低速离心机，北京白洋淀医疗器械有限公司；YP601N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HHW-420型小型三用水箱，北京医疗设备厂。
2 实验方法
2.1 造模
大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，仰卧位固定，先将0.5 mL玻璃注射器针栓轻轻插入大鼠宫颈内，进入即止，约3～4 mm，并向其中缓慢注入25%苯酚胶浆0.15 mL，注入同时缓慢撤针，而后将大鼠头低尾高体位倾斜放置，5 min后放回笼内，隔日1次，共5次[2]。大鼠阴道有黄白色分泌物，阴道壁充血、红肿，表示造模成功。
2.2 分组及给药
50只成模大鼠随机分为模型组、阳性药组和锡类散低、中、高剂量组，每组10只，另取未造模大鼠8只作为正常组。正常组和模型组给予基质栓，锡类散低、中、高剂量组分别给予低、中、高剂量药栓，阳性药组给予阳性对照药物栓。以栓剂进入阴道深部近宫颈口处为准，每日1次，每次1粒，连续10 d。
2.3 一般状况观察
观察大鼠体质量、毛发色泽、饮食、饮水、阴道分泌物及阴道壁变化等。
2.4 指标检测
给药10 d，大鼠腹主动脉取血，血常规分析仪定量测量血液中性粒细胞数和白细胞总数。腹主动脉取血后摘取大鼠宫颈组织，置于10%甲醛标本瓶中浸泡固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，切片（4 μm厚），HE染色，光镜下观察宫颈阴道组织病理形态。
3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况结果
实验过程中除正常组和模型组外，其余4组均有部分大鼠死亡，锡类散低、中、高剂量组大鼠各死亡1只，阳性药组死亡2只，最终进入结果分析大鼠53只。正常组大鼠体质量呈进行性增长，饮食、饮水正常，眼光有神，毛发有光泽，阴道无黄白色分泌物，阴道壁未见充血、红肿；模型组大鼠阴道有黄白色分泌物，阴道壁充血、红肿；锡类散低、中、高剂量组大鼠及阳性药组大鼠阴道有黄白色分泌物，阴道壁不同程度充血、红肿，肉眼观察高剂量组大鼠阴道分泌物情况及充血、红肿程度最严重，阳性药组及低剂量组最轻，中剂量组适中。
4.2 锡类散对模型大鼠血液中性粒细胞数和白细胞总数的影响
与正常组比较，模型组中性粒细胞数、白细胞总数显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，锡类散低剂量组中性粒细胞数、白细胞总数显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），锡类散中剂量组中性粒细胞数、白细胞总数有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），锡类散高剂量组中性粒细胞数显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），白细胞总数有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），阳性药组中性粒细胞数、白细胞总数显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
表1 各组大鼠中性粒细胞数和白细胞总数比较（—x±s，×109/L）
组别 只数 中性粒细胞数 白细胞总数
正常组 8 0.842 5±0.500 8 7.157 5±2.490 5
模型组 10 2.616 0±1.385 0## 10.787 0±1.141 0##
锡类散低剂量组 9 1.167 8±0.273 0* 6.176 7±1.381 0**
锡类散中剂量组 9 1.660 0±0.803 9 10.272 0±0.812 8
锡类散高剂量组 9 4.355 6±2.124 6** 11.997 8±2.583 7
阳性药组 8 0.828 8±0.859 5** 7.086 3±2.482 0**
注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
4.3 锡类散对模型大鼠宫颈组织病理形态学的影响
正常组宫颈与阴道交界处单层柱状上皮移行为复层扁平上皮，细胞排列整齐，黏膜下固有层纤维排列致密，无充血及炎细胞浸润；模型组大鼠宫颈黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层充血水肿，炎细胞浸润，腔内可见大量脓性渗出物，伴有出血及脱落的上皮细胞；锡类散低剂量组宫颈黏膜炎症损伤明显减轻，上皮细胞大多恢复正常，黏膜及黏膜下固有层轻度充血，未见明显炎细胞浸润，腔内未见脓性渗出物、出血及脱落的上皮细胞；锡类散中剂量组宫颈黏膜炎症损伤有一定程度减轻，仍可见部分上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层轻度充血，可见少量炎细胞浸润，腔内未见脓性渗出物及出血，可见少量脱落的上皮细胞；锡类散高剂量组宫颈黏膜未见改善，可见宫颈黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层充血水肿，炎细胞浸润，腔内可见少量脱落的上皮细胞；阳性药组宫颈黏膜炎症损伤有一定程度减轻，仍可见部分上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层轻度充血，可见少量炎细胞浸润，腔内未见脓性渗出物及出血，可见少量脱落的上皮细胞。结果见图1。
正常组 模型组
锡类散低剂量组 锡类散中剂量组
锡类散高剂量组 阳性药组
图1 各组大鼠宫颈组织病理形态（HE染色，×100）
4.4 锡类散对模型大鼠阴道组织病理形态学的影响
正常组阴道黏膜有许多横行皱襞，表面为非角化的复层扁平上皮，细胞排列整齐，黏膜下固有层纤维排列致密，无充血及炎细胞浸润；模型组大鼠阴道黏膜部分缺损，表面被覆上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层充血水肿，炎细胞浸润，腔内可见大量出血及脱落的上皮细胞；锡类散低剂量组阴道黏膜炎症损伤明显减轻，上皮细胞大多已恢复正常，黏膜及黏膜下固有层未见明显充血及炎细胞浸润，未见腔内脓性渗出物、出血及脱落的上皮细胞；锡类散中剂量组阴道黏膜炎症损伤有一定程度减轻，仍可见部分上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层轻度充血，可见少量炎细胞浸润，腔内未见脓性渗出物及出血，可见少量脱落的上皮细胞。锡类散高剂量组阴道黏膜未见改善，可见阴道黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层充血水肿，炎细胞浸润，腔内可见大量出血及少量脱落的上皮细胞；阳性药组阴道黏膜炎症损伤有一定程度减轻，仍可见大量上皮细胞坏死脱落，黏膜及黏膜下固有层轻度充血，可见少量炎细胞浸润，腔内未见脓性渗出物及出血，可见少量脱落的上皮细胞。结果见图2。
正常组 模型组
锡类散低剂量组 锡类散中剂量组
锡类散高剂量组 阳性药组
图2 各组大鼠阴道组织病理形态（HE染色，×100）
5 讨论
“蚀于喉为惑，蚀于阴为狐”，张仲景在《金匮要略》的“狐惑病篇”就言明，“狐”“惑”本为相同病机，只是发作部位不同。依据中医学“谨守病机，各司其属”（《素问·至真要大论篇》），锡类散可治咽喉糜烂、唇舌肿痛证属湿热之毒上侵，锡类散清热解毒、化腐生肌的药物作用恰与宫颈炎湿热下侵、血癖肉腐的病机相吻合。从病理学角度解释，口腔溃疡和宫颈炎均伴有黏膜糜烂或溃疡，两者在病理形态上亦有很多相似之处。所以运用锡类散治疗宫颈炎，理论上也应有较满意的效果，即张仲景所言“观其脉证，知犯何逆，随证治之”（《伤寒论》），这个“证”就是“病机”，这就是中医学的“异病同治”思想。
锡类散的组成药物有象牙屑、青黛、壁钱炭、人指甲（滑石粉制）、珍珠、冰片、牛黄。方中象牙屑清热、拔毒生肌，另外有研究发现，象牙屑中MW14和MW5可以引发相应机制，促进伤口的愈合[3]；青黛清热解毒、凉血，内服和外用均有抗炎镇痛的作用[4]；壁钱炭清热解毒、止血生肌，同时具有良好的抗炎作用[5]；人指甲止血、利尿；珍珠可解毒生肌，从三角帆蛙珍珠中提取的总卟啉成分，可抑制自由基反应，并可清除体内氧自由基[6]；冰片清热止痛，有文献表明冰片外用有良好的抗炎镇痛作用[7]；人工牛黄清热解毒，有明显的抗炎作用[8]。诸药共奏清热解毒、化腐生肌的功效。
血液中白细胞尤其是中性粒细胞能趋化吞噬异物，同时产生多种炎症介质，如前列腺素、白细胞介素等。中性粒细胞介导的组织损伤是急性炎症引起组织损伤的主要原因。本实验结果表明，锡类散低、中剂量组宫颈炎大鼠血液白细胞总数及中性粒细胞数有所下降，推测锡类散能减少大鼠血中白细胞总数及中性粒细胞数，从而减轻其介导的炎症反应。其中锡类散低剂量组白细胞总数及中性粒细胞数较中剂量组下降明显，故本实验中、低剂量组为锡类散治疗大鼠宫颈炎的最佳剂量。而锡类散高剂量组中性粒细胞和白细胞总数较模型组明显增加，提示高剂量组大鼠炎症反应较模型组更重。但查阅文献，并无明确实验研究表明锡类散中药物组成成分有此不良反应，故猜测可能是因为栓剂中药物浓度太高，导致细胞处于高渗液体环境而失水，加重细胞的损伤，从而进一步加剧炎症反应，使中性粒细胞及其他白细胞趋化作用加强，最终导致中性粒细胞和白细胞总数增加。锡类散低、中、高剂量组中性粒细胞有逐步升高的趋势，亦考虑为细胞受损程度随细胞外液体环境渗透压升高而加重，其确切原因有待进一步研究。
病理形态观察结果显示，模型组宫颈黏膜充血水肿明显，炎细胞浸润，腔内可见大量脓性渗出物，伴有出血及脱落的上皮细胞：而锡类散低剂量组宫颈黏膜炎症较模型组损伤明显减轻，黏膜仅有轻度充血，未见明显炎细胞浸润以及炎性渗出物、出血及脱落的上皮细胞。这是因为锡类散的清热解毒和其中各药物的抗炎镇痛作用可以减轻其炎症损伤，使充血水肿减轻；其化腐生肌的功效和象牙屑、珍珠促进伤口愈合的机制有助于祛除已经脱落坏死的组织，清除炎性分泌物，加快新的黏膜和组织的生长。病理观察结果显示，锡类散低剂量组被覆上皮完好率明显高于模型组，鳞柱交界处两种上皮移行部清晰，其形态结构、鳞状上皮层次相较于阳性药组更接近于正常组。其总体炎症改变均较模型组轻微，更接近于正常组。提示锡类散低剂量组对实验动物所造成的阴道及宫颈黏膜的炎性损伤有较理想的治疗作用。
本研究表明，经锡类散治疗后模型大鼠血液白细胞总数及中性粒细胞数均有所下降，说明锡类散能减少大鼠血液白细胞总数，从而减轻其介导的炎症反应，进而促进其黏膜的愈合和再生。
鉴于实验动物研究相关文献中缺乏大鼠标准化栓剂给药方式，且大鼠阴道窄而深的生理特点，为便于实验给药并提高实验结果的可靠性，本实验将锡类散原有散剂改良为栓剂，作用时间较灌肠长（本实验为大鼠用栓，融变时限短，故为5 min，人用栓剂作用时间更长），基本可以达到恒速释药[9]，减少了因药物流失导致的实验误差以及药物浪费，并为锡类散治疗宫颈炎的临床使用提供了实验基础。本实验根据文献确定阴道给药剂量，“至少相当于口服剂量，或口服剂量的1.5～2倍”[10]，将中剂量组设置为散剂最适剂量组的2倍，故低、中、高剂量组分别为临床最适剂量的1、2、4倍。
综上所述，锡类散是用于口腔溃疡的常用中药，我们根据其对黏膜的修复作用探索其对宫颈炎的治疗作用，探寻锡类散运用于黏膜溃疡类疾病的新思路、新方法，为扩大锡类散的临床适用范围和提高宫颈炎的临床疗效提供了实验依据。
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