苗药痛风停汤对急性痛风性关节炎模型大鼠血清IL―8的影响.doc
马鸿斌+王苗慧+孙红旭+杨雪芳
摘要：目的 观察清热排毒胶囊对尿酸钠晶体（MSU）诱导的急性痛风性关节炎模型大鼠核因子κB（NF-κB）和白细胞介素-1β（IL-1β）的影响，探讨其防治急性痛风性关节炎的作用机理。方法 60只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、双氯芬酸钠缓释片组（戴芬组）及清热排毒胶囊高、中、低剂量组，各治疗组予相应药物灌胃7 d，于第5日灌胃给药1 h后采用MSU溶液踝关节腔注射制备大鼠急性痛风性关节炎模型。各组大鼠于造模后48 h处死并取材。光镜下观察各组大鼠踝关节滑膜组织的病理形态学改变，ELISA测定各组大鼠踝关节浸出液中NF-κB和IL-1β的表达水平。结果 与模型组比较，清热排毒胶囊各剂量组和戴芬组大鼠踝关节浸出液中NF-κB和IL-1β的表达水平均显著降低（P<0.05，P<0.01）。病理观察结果显示，清热排毒胶囊可减轻模型大鼠踝关节滑膜组织充血、水肿及炎性细胞浸润，并改善滑膜增生等病理改变。结论 清热排毒胶囊通过抑制大鼠踝关节组织中NF-κB和IL-1β的表达来发挥抗炎作用。
关键词：急性痛风性关节炎；清热排毒胶囊；核因子κB；白细胞介素-1β；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.12.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）12-0042-03
痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱，导致尿酸排泄障碍或生成增多，引起血清尿酸（SUA）浓度升高，处于过饱和状态，产生尿酸盐结晶，沉积于关节及其周围组织，引起急性炎症反应，发为急性痛风性关节炎（GA）。笔者根据痛风病因病机特点结合多年临床经验，自拟萆薢渗湿汤加减制成清热排毒胶囊，用于治疗GA急性发作，屡获良效。本实验通过观察清热排毒胶囊对急性GA模型大鼠滑膜组织病理形态学改变及踝关节浸出液中核因子κB（NF-κB）和白细胞介素-1β（IL-1β）表达的影响，探讨清热排毒胶囊防治急性GA的作用机制及部分作用靶点，为其临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠60只，体质量（200±20）g，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物许可证号：SCXK （甘）2011-0001-0001221。
1.2 药物与试剂
双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊（戴芬），Temmler Werke GmbH生产，75 mg/片，批号104166；清热排毒胶囊由土茯苓、秦艽、萆薢、薏苡仁、延胡索、没药、三七、黄芪等组成，甘肃中医学院附属医院制剂科制成原药材胶囊，0.45 g/粒，批号121022；尿酸钠晶体（MSU），Sigma公司，5 g/瓶，批号10010995。NF-κB和IL-1β ELISA试剂盒，购自上海丽臣商贸有限公司，批号分别为CK-E30028、CK-E30419。
1.3 主要仪器
酶联免疫检测仪（美国BIO-RAD），SHZ-82水浴恒温振荡器（金坛市恒丰仪器厂），BP210S电子分析天平（Sartorius公司），10～500 μL微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组与给药
60只雄性大鼠适应性喂养1周，称重、编号并随机分为空白组、模型组、戴芬组及中药高、中、低剂量组，每组10只。根据人与动物间药物剂量的换算方法，戴芬组予双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊6.8 mg/kg，中药高、中、低剂量组分别予清热排毒胶囊1、0.5、0.25 g/kg，将药物溶于蒸馏水配制成相应浓度的灌胃溶液，根据大鼠体质量按0.1 mL/kg予等量药液，空白组和模型组予等体积蒸馏水。每日1次，连续7 d。
2.2 尿酸钠晶体溶液的配制
用电子天平称取MSU 500 mg，充分研磨至均匀细粉状，加入25 mL生理盐水溶液中，搅拌，充分溶解，制成浓度为20 mg/mL的MSU溶液，置于4 ℃冰箱中备用。
2.3 造模
参照文献[1-2]经典造模方法略作改良制备GA大鼠模型。于实验第5日灌胃给药后1 h，选取受试大鼠右侧踝关节背侧，常规碘伏消毒皮肤，用6号注射针与胫骨成45°方向插入踝关节腔，至针尖有落空感，将100 μL MSU溶液注入踝关节腔，以关节腔对侧隆起为注入标准。空白组予等体积生理盐水溶液关节腔注射。
2.4 检测指标
造模48 h后将所有实验动物用过量水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉处死，剪取右侧踝关节，将其置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后取出，用4%盐酸水溶液脱钙至细针可以顺利穿过为准，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察各组大鼠踝关节滑膜组织的病理形态学改变；取另一右侧踝关节，去皮，剪开关节腔及其周围组织，浸泡于盛有3 mL生理盐水的离心管中，恒温震荡10 min后再浸泡1 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液分装于EP管中，-80 ℃低温冰箱冻存待测相关指标。ELISA检测大鼠踝关节浸出液中NF-κB和IL-1β的含量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。所有数据均以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett's T2法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 清热排毒胶囊对模型大鼠踝关节浸出液中核因子κB和白细胞介素-1β表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠踝关节浸出液中NF-κB和IL-1β表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组NF-κB和IL-1β表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；中药低剂量组NF-κB表达与戴芬组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。endprint
4.2 滑膜组织病理形态学观察
空白组大鼠踝关节滑膜组织可见滑膜表面被覆单层细胞，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠关节炎症较明显，滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，间质水肿，可见大量中性粒细胞等炎性细胞浸润；清热排毒胶囊各剂量组和戴芬组关节炎症均不同程度减轻，周围软组织充血不明显，见少量炎性细胞浸润，滑膜略有增生样改变、排列紊乱，炎性细胞浸润较模型组明显减少。见图1。
5 讨论
近年来，随着社会经济的发展，人们饮食结构、生活方式的改变，痛风的患病率呈逐年上升趋势。痛风是由于长期嘌呤代谢紊乱所致，临床以高尿酸血症、急性关节炎反复发作、痛风石沉积、慢性关节炎和关节畸形、肾实质性病变和尿酸石形成为特点，属中医“痹证”、“历节病”、“痛风”等范畴。痛风性关节炎多因先天禀赋不足，脾肾亏虚，加之平素嗜食醇酒厚味，脾失健运，内生湿浊，或劳欲过度，外邪侵袭，湿浊阻滞，郁久化热，痹阻经络关节，气血运行不畅，浊瘀互结[3]，引起关节肌肉疼痛、麻木、重着、屈伸不利而成痹证。其证为本虚标实，虚实夹杂，以脾肾亏虚为本，湿热、痰浊、血瘀为标，加之外邪侵袭为诱因，三者共同作用发展为本病。本病初起属实证，多为湿热痹阻、气血瘀滞，据其病因病机特点，自拟萆薢渗湿汤加减制成清热排毒胶囊用于GA急性发作期。方中重用萆薢、土茯苓利湿清热、通利关节，共为君药；臣以秦艽、薏苡仁、黄芪等清热利湿、健脾除痹；佐以延胡索、没药、三七等活血化瘀、消肿止痛；使以陈皮健脾行气，甘草顾护脾胃、调和诸药。诸药合用，共奏清热利湿排毒、活血消肿止痛之功。本实验结果表明，模型组大鼠关节滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，大量中性粒细胞等炎性细胞浸润，关节炎症较明显，与人类急性GA的病理变化相似，说明造模成功。清热排毒胶囊和戴芬均能显著改善GA大鼠关节的病理损害，减轻关节的炎性症状，从病理形态学角度显示出清热排毒胶囊防治急性GA的有效性。
目前研究发现，多种信号传导通路在GA的炎症反应中发挥重要作用，已明确MSU可以激活Toll样受体2、Toll样受体4，促使NF-κB的核内转移及基因转录、表达[4]。研究表明，在GA病理发展过程中，MSU诱导NF-κB活化，活化的NF-κB能启动和调节众多与炎症免疫反应有关的炎症介质、黏附分子和酶等基因表达，上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β等炎性细胞因子基因的转录，使IL-1β和TNF-α的产生和释放增多，IL-1β和TNF-α可再次激活NF-κB，产生级联反应，引起炎症反应的持续和放大，加重病情的发展[5]。本研究结果显示，清热排毒胶囊各剂量组NF-κB和IL-1β的表达水平与模型组比较显著降低（P<0.05，P<0.01），提示其可能通过抑制NF-κB和IL-1β的表达，减轻急性GA的滑膜炎症，从而发挥其抗炎作用。且IL-1β的表达呈现与NF-κB相似的特点，说明IL-1β的表达与NF-κB的活化密切相关。但其是否通过抑制急性GA模型大鼠踝关节浸出液中NF-κB的活性而降低IL-1β的表达，尚需进一步研究。
参考文献：
[1] Coderre TJ， Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund's adjuvant[J]. Pain，1987，28（3）：379-393.
[2] Coderre TJ， Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents[J]. Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461-466.
[3] 韦少玲.痛风病的中医发病机制研究进展[J].光明中医，2009，24（6）：1187-1188.
[4] 赵富强.基于“TLR/NF-κB”信号通路研究痛风宁颗粒抗炎、镇痛的机制[D].福州：福建中医药大学，2012.
[5] 郑仲瑾.核转录因子κB在全身炎症综合征中的作用[J].免疫学杂志， 2001，17（4）：314-317.
（收稿日期：2014-01-20；编辑：华强）endprint
4.2 滑膜组织病理形态学观察
空白组大鼠踝关节滑膜组织可见滑膜表面被覆单层细胞，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠关节炎症较明显，滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，间质水肿，可见大量中性粒细胞等炎性细胞浸润；清热排毒胶囊各剂量组和戴芬组关节炎症均不同程度减轻，周围软组织充血不明显，见少量炎性细胞浸润，滑膜略有增生样改变、排列紊乱，炎性细胞浸润较模型组明显减少。见图1。
5 讨论
近年来，随着社会经济的发展，人们饮食结构、生活方式的改变，痛风的患病率呈逐年上升趋势。痛风是由于长期嘌呤代谢紊乱所致，临床以高尿酸血症、急性关节炎反复发作、痛风石沉积、慢性关节炎和关节畸形、肾实质性病变和尿酸石形成为特点，属中医“痹证”、“历节病”、“痛风”等范畴。痛风性关节炎多因先天禀赋不足，脾肾亏虚，加之平素嗜食醇酒厚味，脾失健运，内生湿浊，或劳欲过度，外邪侵袭，湿浊阻滞，郁久化热，痹阻经络关节，气血运行不畅，浊瘀互结[3]，引起关节肌肉疼痛、麻木、重着、屈伸不利而成痹证。其证为本虚标实，虚实夹杂，以脾肾亏虚为本，湿热、痰浊、血瘀为标，加之外邪侵袭为诱因，三者共同作用发展为本病。本病初起属实证，多为湿热痹阻、气血瘀滞，据其病因病机特点，自拟萆薢渗湿汤加减制成清热排毒胶囊用于GA急性发作期。方中重用萆薢、土茯苓利湿清热、通利关节，共为君药；臣以秦艽、薏苡仁、黄芪等清热利湿、健脾除痹；佐以延胡索、没药、三七等活血化瘀、消肿止痛；使以陈皮健脾行气，甘草顾护脾胃、调和诸药。诸药合用，共奏清热利湿排毒、活血消肿止痛之功。本实验结果表明，模型组大鼠关节滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，大量中性粒细胞等炎性细胞浸润，关节炎症较明显，与人类急性GA的病理变化相似，说明造模成功。清热排毒胶囊和戴芬均能显著改善GA大鼠关节的病理损害，减轻关节的炎性症状，从病理形态学角度显示出清热排毒胶囊防治急性GA的有效性。
目前研究发现，多种信号传导通路在GA的炎症反应中发挥重要作用，已明确MSU可以激活Toll样受体2、Toll样受体4，促使NF-κB的核内转移及基因转录、表达[4]。研究表明，在GA病理发展过程中，MSU诱导NF-κB活化，活化的NF-κB能启动和调节众多与炎症免疫反应有关的炎症介质、黏附分子和酶等基因表达，上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β等炎性细胞因子基因的转录，使IL-1β和TNF-α的产生和释放增多，IL-1β和TNF-α可再次激活NF-κB，产生级联反应，引起炎症反应的持续和放大，加重病情的发展[5]。本研究结果显示，清热排毒胶囊各剂量组NF-κB和IL-1β的表达水平与模型组比较显著降低（P<0.05，P<0.01），提示其可能通过抑制NF-κB和IL-1β的表达，减轻急性GA的滑膜炎症，从而发挥其抗炎作用。且IL-1β的表达呈现与NF-κB相似的特点，说明IL-1β的表达与NF-κB的活化密切相关。但其是否通过抑制急性GA模型大鼠踝关节浸出液中NF-κB的活性而降低IL-1β的表达，尚需进一步研究。
参考文献：
[1] Coderre TJ， Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund's adjuvant[J]. Pain，1987，28（3）：379-393.
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[3] 韦少玲.痛风病的中医发病机制研究进展[J].光明中医，2009，24（6）：1187-1188.
[4] 赵富强.基于“TLR/NF-κB”信号通路研究痛风宁颗粒抗炎、镇痛的机制[D].福州：福建中医药大学，2012.
[5] 郑仲瑾.核转录因子κB在全身炎症综合征中的作用[J].免疫学杂志， 2001，17（4）：314-317.
（收稿日期：2014-01-20；编辑：华强）endprint
4.2 滑膜组织病理形态学观察
空白组大鼠踝关节滑膜组织可见滑膜表面被覆单层细胞，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠关节炎症较明显，滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，间质水肿，可见大量中性粒细胞等炎性细胞浸润；清热排毒胶囊各剂量组和戴芬组关节炎症均不同程度减轻，周围软组织充血不明显，见少量炎性细胞浸润，滑膜略有增生样改变、排列紊乱，炎性细胞浸润较模型组明显减少。见图1。
5 讨论
近年来，随着社会经济的发展，人们饮食结构、生活方式的改变，痛风的患病率呈逐年上升趋势。痛风是由于长期嘌呤代谢紊乱所致，临床以高尿酸血症、急性关节炎反复发作、痛风石沉积、慢性关节炎和关节畸形、肾实质性病变和尿酸石形成为特点，属中医“痹证”、“历节病”、“痛风”等范畴。痛风性关节炎多因先天禀赋不足，脾肾亏虚，加之平素嗜食醇酒厚味，脾失健运，内生湿浊，或劳欲过度，外邪侵袭，湿浊阻滞，郁久化热，痹阻经络关节，气血运行不畅，浊瘀互结[3]，引起关节肌肉疼痛、麻木、重着、屈伸不利而成痹证。其证为本虚标实，虚实夹杂，以脾肾亏虚为本，湿热、痰浊、血瘀为标，加之外邪侵袭为诱因，三者共同作用发展为本病。本病初起属实证，多为湿热痹阻、气血瘀滞，据其病因病机特点，自拟萆薢渗湿汤加减制成清热排毒胶囊用于GA急性发作期。方中重用萆薢、土茯苓利湿清热、通利关节，共为君药；臣以秦艽、薏苡仁、黄芪等清热利湿、健脾除痹；佐以延胡索、没药、三七等活血化瘀、消肿止痛；使以陈皮健脾行气，甘草顾护脾胃、调和诸药。诸药合用，共奏清热利湿排毒、活血消肿止痛之功。本实验结果表明，模型组大鼠关节滑膜细胞显著增生、肥大，排列紊乱，滑膜增厚，大量中性粒细胞等炎性细胞浸润，关节炎症较明显，与人类急性GA的病理变化相似，说明造模成功。清热排毒胶囊和戴芬均能显著改善GA大鼠关节的病理损害，减轻关节的炎性症状，从病理形态学角度显示出清热排毒胶囊防治急性GA的有效性。
目前研究发现，多种信号传导通路在GA的炎症反应中发挥重要作用，已明确MSU可以激活Toll样受体2、Toll样受体4，促使NF-κB的核内转移及基因转录、表达[4]。研究表明，在GA病理发展过程中，MSU诱导NF-κB活化，活化的NF-κB能启动和调节众多与炎症免疫反应有关的炎症介质、黏附分子和酶等基因表达，上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β等炎性细胞因子基因的转录，使IL-1β和TNF-α的产生和释放增多，IL-1β和TNF-α可再次激活NF-κB，产生级联反应，引起炎症反应的持续和放大，加重病情的发展[5]。本研究结果显示，清热排毒胶囊各剂量组NF-κB和IL-1β的表达水平与模型组比较显著降低（P<0.05，P<0.01），提示其可能通过抑制NF-κB和IL-1β的表达，减轻急性GA的滑膜炎症，从而发挥其抗炎作用。且IL-1β的表达呈现与NF-κB相似的特点，说明IL-1β的表达与NF-κB的活化密切相关。但其是否通过抑制急性GA模型大鼠踝关节浸出液中NF-κB的活性而降低IL-1β的表达，尚需进一步研究。
参考文献：
[1] Coderre TJ， Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund's adjuvant[J]. Pain，1987，28（3）：379-393.
[2] Coderre TJ， Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents[J]. Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461-466.
[3] 韦少玲.痛风病的中医发病机制研究进展[J].光明中医，2009，24（6）：1187-1188.
[4] 赵富强.基于“TLR/NF-κB”信号通路研究痛风宁颗粒抗炎、镇痛的机制[D].福州：福建中医药大学，2012.
[5] 郑仲瑾.核转录因子κB在全身炎症综合征中的作用[J].免疫学杂志， 2001，17（4）：314-317.
（收稿日期：2014-01-20；编辑：华强）endprint
