当归中阿魏酸含量测定及质量标准的研究.pdf
李越峰+吴平安+刘峰林+等
摘要：目的 探讨趁鲜切片对当归质量的影响，为科学评价及有效控制当归趁鲜切片的质量提供可靠方法，并对当归趁鲜切片及当归饮片的质量进行比较。方法 采用高效液相色谱法测定当归中阿魏酸含量。提取方法、色谱条件均在2010年版《中华人民共和国药典》基础上进行了优化。色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：28 ℃。结果 趁鲜切片的当归中阿魏酸含量高于当归饮片中阿魏酸的含量，在外部其他条件相同时，当归趁鲜切片用70%甲醇超声提取30 min时所得阿魏酸的含量最高。结论 本试验测定当归中阿魏酸含量的方法操作简单、可靠，重复性好，可作为当归质量控制的有效方法。
关键词：当归饮片；趁鲜切片；阿魏酸；高效液相色谱法
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis （oliv） Diels的干燥根[1]124，其味甘而重，故专能补血，其气轻而辛，故又能行血，补中有动，行中有补，为血中之气药。当归饮片传统加工方法是将干燥药材二次软化后进行切制、炮制。由于当归采收后产地加工复杂，费工费时，且容易霉变腐烂，所以，如果能趁鲜将当归切制成饮片，则不仅省去了药材产地加工工
基金项目：国家自然科学基金（81073077）；教育部科学技术研究重点项目（212186）；甘肃省自然科学基金（1010RJZA212）；甘肃省高等院校基本科研业务费专项资金（2013-2）；甘肃中医学院引进人才科研启动基金（2010-3）
通讯作者：严兴科，E-mail：lyfyxk@126.com
序，而且避免了二次软化过程中药效成分的损失[2-3]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），选择当归的主要药效成分阿魏酸作为定量评价指标，对传统加工方法和趁鲜切制加工炮制方法加工的饮片进行比较，考察其整体质量变化，探讨趁鲜切制方法能否代替传统饮片切制方法。
1 仪器与试药
Aglient 1200高效液相色谱仪；CS101-1电热风干燥器，中国重庆试验设备制造厂；B-20气流烘干器，河南省巩义市甘埔仪器厂；BS2245分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；B*7200HP超声波清洗机，上海新苗医疗器械厂。
当归饮片（惠仁堂购买，产地岷县，批号1112041M）；新鲜当归（产地岷县，采集后未经任何加工），经本校生药学教研室李成义教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）当归项下规定。阿魏酸对照品（HPLC纯度>98%，中国药品生物制品检定所，批号1100-201112）。无水乙醇为分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司），水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司）。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品0.275 0 g，置50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，用5 mL移液管吸取3 mL加入50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，制得0.33 mg/mL的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取当归趁鲜切片经粉碎的粉末7份（0.510 1、0.510 4、0.510 2、0.510 8、0.510 1、0.5107、0.510 0 g），分别置于容量瓶中，编号1～7，1号瓶加入70%甲醇溶液超声提取30 min，2号瓶加入70%甲醇溶液超声提取40 min，3号瓶中加入75%甲醇超声30 min， 4号瓶加入75%甲醇超声40 min，5号瓶加入70%乙醇超声30 min，6号瓶加入80%甲醇超声30 min，7号瓶加入80%甲醇超声提取40 min，先用滤纸过滤，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得当归趁鲜切片供试品溶液1～7。精密称取当归饮片经粉碎的粉末3份（0.5103、0.5101、0.5100 g），分别置于容量瓶中，依次分别加入70%甲醇溶液、80%甲醇溶液、70%乙醇溶液分别超声提取30、40、30 min，先用滤纸过滤，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得当归饮片供试品溶液1～3。
2.3 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：28 ℃；流动相：乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱（0～25 min， 90%～16%A）。
2.4 线性关系考察
精密吸取上述阿魏酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，进样10 μL测定，得阿魏酸回归方程Y=25.387 9X-41.280 0，r2=0.9998 （n=5），结果表明阿魏酸在0.033～0.165 μg范围内有良好的线性关系。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，分别测定6次，阿魏酸峰面积的RSD=1.13%（n=6），结果表明精密度良好。
2.5.2 重复性试验 取70%甲醇超声提取的饮片供试品，在上述色谱条件下进样6次，测得阿魏酸含量RSD=0.93%，结果表明重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、6、12、24、36、72 h各进样10 μL，测定阿魏酸峰面积积分值，RSD=1.02%，结果表明稳定性良好。
2.5.4 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的2.6 当归趁鲜切片和当归饮片含量测定
2.7 当归饮片及当归趁鲜切片水分测定
照水分测定法（2010年版《中华人民共和国药典》附录Ⅸ H第一法）[1]附录52，取供试品适量，精密称定，连接装置，置于圆底烧瓶中，自冷凝管顶部加入甲苯200 mL，将圆底烧瓶放入电热套中加热，待甲苯沸腾时，控制每分钟滴2滴，待水完全馏出，不再增加，用甲苯冲洗冷凝管内部，继续蒸馏5 min，放冷至常温，拆卸装置，若二层管壁有水滴，可用蘸有甲苯的铜丝推下，放置使水和甲苯分离，检测水量。测得当归趁鲜切片和当归饮片的含水量分别为1.2、1.6 mL，见表3。
2.8 当归趁鲜切片浸出物测定
3 讨论
在色谱条件方面，用甲醇-水与乙腈-水梯度洗脱系统对同一样品进行分析，结果表明，甲醇-水梯度洗脱基线漂移较重，色谱峰宽，峰形不好，出峰数目少，乙腈-水梯度洗脱系统更好。用乙腈-水与乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统对同一样品进行分析，乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多、峰形好，优于乙腈-水梯度洗脱系统，故流动相系统选用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱。将供试品溶液分别在322、320、316、254、270 nm处检测，结果表明，316 nm出峰数目最多，阿魏酸在316 nm处有最大吸收峰，且各峰响应值较高，基线稳定，故选之。本方法在药典基础上进行了优化，药典采用乙腈-0.085%磷酸梯度洗脱所得峰的干扰峰、分离度及峰形均不如本方法。
在提取方法上，本试验通过提取溶剂种类、提取溶剂浓度、提取时间的改变，优选当归最佳提取工艺，结果表明用70%甲醇超声30 min效果较好，能有效提取出当归中的阿魏酸，并且提取时间短。同时，将本方法与药典提取方法进行了比较，结果本法提取率高。
本试验采用HPLC对当归趁鲜切片和当归饮片中
阿魏酸含量进行测定，精密度、重复性、稳定性良好，回收率高，操作简单、可靠，可作为甘肃道地药材当归质量控制的有效方法。
通过试验得到趁鲜切片的当归中阿魏酸含量高于当归饮片，在外部其他条件相同时，当归趁鲜切片用70%甲醇超声提取30 min时所得阿魏酸含量最高。本试验为当归趁鲜切片的可行性研究提供了依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 段然，薛润光，李军，等.用HPLC-DAD的方法评价不同产地当归药材的质量[J].中国现代中药，2009，22（8）：195-199.
[3] 宋金春，胡传芹，刘红，等.炮制对当归药材有效成分的影响[J].中国药学杂志，2007，32（14）：78-90.
（收稿日期：2013-09-23；编辑：陈静）
照水分测定法（2010年版《中华人民共和国药典》附录Ⅸ H第一法）[1]附录52，取供试品适量，精密称定，连接装置，置于圆底烧瓶中，自冷凝管顶部加入甲苯200 mL，将圆底烧瓶放入电热套中加热，待甲苯沸腾时，控制每分钟滴2滴，待水完全馏出，不再增加，用甲苯冲洗冷凝管内部，继续蒸馏5 min，放冷至常温，拆卸装置，若二层管壁有水滴，可用蘸有甲苯的铜丝推下，放置使水和甲苯分离，检测水量。测得当归趁鲜切片和当归饮片的含水量分别为1.2、1.6 mL，见表3。
2.8 当归趁鲜切片浸出物测定
3 讨论
在色谱条件方面，用甲醇-水与乙腈-水梯度洗脱系统对同一样品进行分析，结果表明，甲醇-水梯度洗脱基线漂移较重，色谱峰宽，峰形不好，出峰数目少，乙腈-水梯度洗脱系统更好。用乙腈-水与乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统对同一样品进行分析，乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多、峰形好，优于乙腈-水梯度洗脱系统，故流动相系统选用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱。将供试品溶液分别在322、320、316、254、270 nm处检测，结果表明，316 nm出峰数目最多，阿魏酸在316 nm处有最大吸收峰，且各峰响应值较高，基线稳定，故选之。本方法在药典基础上进行了优化，药典采用乙腈-0.085%磷酸梯度洗脱所得峰的干扰峰、分离度及峰形均不如本方法。
在提取方法上，本试验通过提取溶剂种类、提取溶剂浓度、提取时间的改变，优选当归最佳提取工艺，结果表明用70%甲醇超声30 min效果较好，能有效提取出当归中的阿魏酸，并且提取时间短。同时，将本方法与药典提取方法进行了比较，结果本法提取率高。
本试验采用HPLC对当归趁鲜切片和当归饮片中
阿魏酸含量进行测定，精密度、重复性、稳定性良好，回收率高，操作简单、可靠，可作为甘肃道地药材当归质量控制的有效方法。
通过试验得到趁鲜切片的当归中阿魏酸含量高于当归饮片，在外部其他条件相同时，当归趁鲜切片用70%甲醇超声提取30 min时所得阿魏酸含量最高。本试验为当归趁鲜切片的可行性研究提供了依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 段然，薛润光，李军，等.用HPLC-DAD的方法评价不同产地当归药材的质量[J].中国现代中药，2009，22（8）：195-199.
[3] 宋金春，胡传芹，刘红，等.炮制对当归药材有效成分的影响[J].中国药学杂志，2007，32（14）：78-90.
（收稿日期：2013-09-23；编辑：陈静）
照水分测定法（2010年版《中华人民共和国药典》附录Ⅸ H第一法）[1]附录52，取供试品适量，精密称定，连接装置，置于圆底烧瓶中，自冷凝管顶部加入甲苯200 mL，将圆底烧瓶放入电热套中加热，待甲苯沸腾时，控制每分钟滴2滴，待水完全馏出，不再增加，用甲苯冲洗冷凝管内部，继续蒸馏5 min，放冷至常温，拆卸装置，若二层管壁有水滴，可用蘸有甲苯的铜丝推下，放置使水和甲苯分离，检测水量。测得当归趁鲜切片和当归饮片的含水量分别为1.2、1.6 mL，见表3。
2.8 当归趁鲜切片浸出物测定
3 讨论
在色谱条件方面，用甲醇-水与乙腈-水梯度洗脱系统对同一样品进行分析，结果表明，甲醇-水梯度洗脱基线漂移较重，色谱峰宽，峰形不好，出峰数目少，乙腈-水梯度洗脱系统更好。用乙腈-水与乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统对同一样品进行分析，乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多、峰形好，优于乙腈-水梯度洗脱系统，故流动相系统选用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱。将供试品溶液分别在322、320、316、254、270 nm处检测，结果表明，316 nm出峰数目最多，阿魏酸在316 nm处有最大吸收峰，且各峰响应值较高，基线稳定，故选之。本方法在药典基础上进行了优化，药典采用乙腈-0.085%磷酸梯度洗脱所得峰的干扰峰、分离度及峰形均不如本方法。
在提取方法上，本试验通过提取溶剂种类、提取溶剂浓度、提取时间的改变，优选当归最佳提取工艺，结果表明用70%甲醇超声30 min效果较好，能有效提取出当归中的阿魏酸，并且提取时间短。同时，将本方法与药典提取方法进行了比较，结果本法提取率高。
本试验采用HPLC对当归趁鲜切片和当归饮片中
阿魏酸含量进行测定，精密度、重复性、稳定性良好，回收率高，操作简单、可靠，可作为甘肃道地药材当归质量控制的有效方法。
通过试验得到趁鲜切片的当归中阿魏酸含量高于当归饮片，在外部其他条件相同时，当归趁鲜切片用70%甲醇超声提取30 min时所得阿魏酸含量最高。本试验为当归趁鲜切片的可行性研究提供了依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 段然，薛润光，李军，等.用HPLC-DAD的方法评价不同产地当归药材的质量[J].中国现代中药，2009，22（8）：195-199.
[3] 宋金春，胡传芹，刘红，等.炮制对当归药材有效成分的影响[J].中国药学杂志，2007，32（14）：78-90.
（收稿日期：2013-09-23；编辑：陈静）
