文章转载自“安捷伦诊断与基因组学”公众号
选择固定剂的挑战在于组织标本中抗原或分子靶标的数量是有限的。尽管固定意味着保留这些成分通过改变蛋白质结构防止洗脱、迁移或降解，但也可能破坏或掩盖这些靶标。虽然有许多固定剂配方，但其中大部分可分为三大类：含福尔马林配方；含酒精配方；以及包含两者组合的配方。无论选择何种固定剂，溶液的制备和使用都必须一致。在 影响 IHC 结果的许多分析前因素中，固定可能是最重要的，其会影响许多其他情况，例如抗原修复和表位结合。遗憾的是，迄今为止，没有一种固定剂经证明可完美适用于所有靶标和检测方法。然而，组织“固定不足”通常比“固定过度”更有害。
10% NBF
最常用的固定剂是 pH 值为 7.0 - 7.4 的 10% 中性缓冲福尔马林溶液（NBF）(9)。这种固定剂是“金标准”，可能是因为其成分相对便宜，而且溶液制备简单且储存稳定，长期以来一直为病理学家所用。福尔马林渗透进组织，并在蛋白质中的活性氨基团之间形成交联， 从而实现固定。当然，这里简述固定期间的反应步骤。重要的是，各个步骤的速率是不同的，并且反应的速度均慢于渗透速度。正是这些差异导致人们对 10% NBF 适当固定各种标本的可接受时间长度产生了混淆。厚度为 4 mm 的 组织应在室温下固定至少 24 小时 (10)。
由于 NBF 的交联特性，NBF 成为所有分子，例如激素等，都是一种特别好的固定剂(1)。福尔马林固定的渐进性交联性质通常会导致潜在的 IHC 或 ISH 抗原或分子靶标被掩盖，这意味着固定终点的重要性不亚于固定的开始时间。有许多情况中，固定剂时间会导致对染色模式的判读不正确。其中一个例子是 Ki-67 和 cyclin D1 的蛋白在“固定不当”标本细胞核中降解。
图 2.4 在组织处理的第一步中，将 SK-BR-3 细胞团在 10% NBF 中固定过夜， 然后转移到 70% 酒精中（左），或在处理前直接转入 70% 酒精中（右）。后者缺乏固定导致 Ki-67 和细胞周期蛋白 D1 免疫反应丧失。切片使用 Autostainer Link 48 平台进行染色，采用 FLEX 检测和以下 FLEX RTU 一抗：MIB-1 (Ki-67) 和 EP12 (Cyclin D1)。
抗原修复技术可释放 NBF 固定所掩盖的抗原或分子靶标。然而，如果没有完整的信息，很难选择合适的抗原修复方案来产生准确的结果。现代热修复的方法似乎适用于相对广泛的固定时间（图 2.5）。然而，在固定时间过短或过长的组织中，可能需要调整热修复的时间，在采用最短 24 小时的 NBF 建议固定时间的实验室中，此调整尚存在争议。对于蛋白水解修复方法，胰蛋白酶或胃蛋白酶的消化时间与固定时间成正比。如图 2.5 所示。必须强调的是，是否需要修复和最佳方案的选择是根据抗原表位来决定，而不是根据抗原来决定，因此同一蛋白不同的单克隆抗体可能需要不同的方法。
图 2.5 长时间固定会影响扁桃体边缘区 B 细胞中 IgM 的免疫反应。本图片显示固定数天的扁桃体次级淋巴滤泡套层中 B 淋巴细胞中 IgM 的免疫反应降低。 本图还进一步说明当企图恢复免疫反应时，不同的抗原修复方法会产生不同的结果。在顶行的 4 张图像中，组织固定时间为 8、32、56 和 104 小时，使用靶标修复溶液（高 pH 值）在 97 下处理切片 20 分钟，套区染色大致相同。而在底行中，使用胰蛋白酶（0.1%，30 分钟）进行靶标修复。在此情况下，组织固定 8 和 32 小时后，抗原被遮盖，但在固定 56 和 104 小时的组织中抗原显著减少。延长胰蛋白酶酶解时间会损坏固定时间较短的样品，但会导致固定 2 或 4 天的组织中 IgM 的染色强度增加（未显示）。需要对实验室中验证的每种新抗原进行此类比较。
福尔马林可视为 II 类致癌物。即使是福尔马林气体也有固定能力。这使其成为安全考量中的主要目标。使用此产品时应始终采用良好的实验室规范。已经提出了许多替代 10% NBF 的固定剂，未来可能会有避免福尔马林使用的趋势，转向更“分子友好型”的固定剂。然而，在后勤和实际操作上，换用另一种固定剂是非常困难的。
酒精固定
如果组织在处理成石蜡之前在 10% NBF 中的固定时间不足 6 小时，该组织可能在酒精或者福尔马林和酒精不同组合中进行了固定。这种非标准化的固定类型可能会导致假阴性或阳性结果。酒精通过凝结和沉淀蛋白质来固定，并且容易提取低分子量碳水化合物等组织成分。酒精还容易使组织脱水，导致收缩和硬化。酒精固定相比福尔马林固定的 一个优势在于通常不需要抗原修复。相比于福尔马林，酒精最初更容易渗透和固定组织（但随后渗透速度减慢），通常建议用于核酸处理。
加强固定
有一些固定方法结合了微波或超声波技术。在这两种方法中，分子的激发都会产生热量并加速反应速率 (1)。该效果还可松散细胞结构，进而加速溶液的渗透。然而，微波固定可能会导致组织固定不均匀，这可能会随着标本的大小和成分以及所用微波的类型而变化 (10)。微波组织可能直接导致蛋白质凝固，并且可能导致组织变硬或“过度加热”。
以上内容仅限研究使用。不可用于诊断目的。
