细胞自噬介绍与相关研究.ppt
史敏 陈雷 尚丛珊 杜剑青 封兴华
[摘要]衰老是每个生命体从生到亡的必经阶段，自噬是继凋亡之后目前生命科学研究最热的领域之一。本文从细胞自噬功能增强和减弱两个角度，分析了其对衰老过程的影响，文中对关于衰老与自噬这两者之间相关性的研究进行了回顾，从分子水平分析了mTOR和AMPK信号通路及p53蛋白在衰老–自噬这一细胞适应内外环境重要的调节机制中的作用，从而提示细胞自噬可以调节细胞衰老进程，因此，利用细胞自噬来治疗某些衰老性疾病（癌症、心脑血管病、神经退行性疾病等）必将成为未来医学研究的重点。
[关键词]衰老；细胞自噬；mTOR-AMPK信号通路；p53；研究进展
[中图分类号]R339.3+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0136-05
Advances in the Correlation between Autophagy and Aging
SHI Min1， CHEN Lei1， SHANG Cong-shan1， DU Jian-qing2， FENG Xing-hua1
（1.Xi'an Peihua University，Xi'an 710125，Shaanxi，China；2.Xi'an Jiaotong University School of Medicine，Xi'an 710061，Shaanxi，China）
Abstract： Aging is one of the necessary stage for every organism from birth to death，and autophagy is one of the most popular fieldss of current life science research following apoptosis. We analyzed the effects of autophagy on the aging process from enhancement and attenuation of the cell autophagy function， reviewed related studies on the correlation between aging and autophagy， and analyzed the role of mTOR， AMPK signaling pathway and p53 protein at the molecular level on aging-autophagy， the important regulatory mechanism by which cells adapt to internal and external environment. Thus suggested that autophagy can regulate cell aging process. Therefore， the use of cell autophagy to treat some aging diseases （such as cancer， cardiovascular disease， neurodegenerative diseases， etc.） will surely be the focus of future medical research.
Key words： aging； autophagy； mTOR-AMPK signaling pathway； p53 protein； review
衰老（Senescence or Aging）是每個生命的必经之途，是生物体在伴随年龄增长中所出现的各器官功能逐渐减退的表现形式。从分子水平来看，衰老的发生与受损细胞器和变性蛋白的累积有关，尤其是线粒体的受损和功能异常是衰老过程中最重要的一个病理特征。当线粒体受损后导致细胞内氧化–磷酸化障碍、活性氧（ROS）蓄积、错误折叠蛋白累积，以此形成恶性循环。因此，在衰老过程中细胞内损伤或有害物质的累积成为衰老细胞的普遍特征，然而良好的功能调节系统和受损细胞器的清除是细胞稳态维持的关键所在，这也是延长细胞生存能力和寿命的关键所在。
细胞自噬能够消除受损细胞器，帮助细胞抵抗恶劣应激条件，使受损细胞器和有害成分经溶酶体酶降解，降解产物再用于合成细胞生存所需的蛋白质或损伤细胞的修复原料。简而言之，自噬就是细胞自身降解并回收已受损或功能丧失的零部件过程，降解材料既可为细胞提供能量，也可作为应急所需。最新研究表明，细胞自噬与机体衰老密切相关，在衰老机制研究中，随着年龄增长，自噬功能逐渐丧失，自噬效率也相应降低[1]，自噬水平因基因功能缺失使机体寿命缩短。相反，经各因素诱导增强自噬功能可延长生物体寿命。因此，细胞自噬能够改善蛋白质内稳态和线粒体内稳态，从而延缓器官功能退化，实现寿命延长[2]。显然，细胞自噬在衰老病因学研究及抗衰老机制研究中具有非常重要地位，本文就细胞自噬与衰老的相关性研究进展进行综述。
1 细胞自噬的机制及功能
1.1 自噬的概念及由来：细胞自噬（Autophagy）是目前继凋亡之后生命科学最热的研究领域之一。“自噬”一词源于英文“self-eating”，意为“自食”，是Ashford和Porter于1962年在肝细胞内发现。1963年由比利时科学家Christian de Duve在溶酶体国际会议上首次提出并将其命名为“自噬”，1974年他因对该领域的卓越贡献获得当年诺贝尔生理学或医学奖。
自噬，是细胞面临短暂的生存压力（如营养缺乏无法供给）时，通过细胞内溶酶体降解无用或有害成分以维持生命的过程。细胞自噬在衰老细胞器的更新和质量控制中起着关键作用，自噬可调节细胞生长、实现细胞内物质和能量的稳态维持[3]。自噬有三种[4]：巨自噬（macroautophagy，MA）、伴侣蛋白介导自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）和微自噬（microautophagy）。MA是将受损或衰老的细胞器、错误折叠或变性的蛋白质，或入侵的微生物吞噬后进入拥有双层包膜的囊泡中，形成双层膜结构的自噬体，并与溶酶体融合后消化降解，降解后的生物大分子再被释放回细胞质内循环再利用，供细胞在应对恶劣环境时循环再利用，实现了机体组织细胞的新陈代谢。CMA是底物在细胞质和溶酶体中的伴侣蛋白或共伴侣蛋白的帮助下，选择性作用于含有KFERQ（Lys-Phe-Glu-Arg-Gln）五肽片段蛋白，后直接进入溶酶体腔降解。除泛素–蛋白酶体系统降解蛋白外，胞内溶质中约有30%蛋白质经CMA代谢[5]。生物体在长时间饥饿或氧化应激下，CMA功能明显增强。微自噬，即经溶酶体膜内陷包裹蛋白质或所吞噬的胞质形成囊泡，之后囊泡被夹断进入溶酶体腔，在腔内经蛋白酶降解。通常在一般性饥饿刺激下可发生微自噬。三类自噬中，一般所说的自噬是指MA。MA是细胞自噬的主要形式，是目前被研究最多的一种，也是目前自噬范畴研究最深的一种。
1.2 自噬的功能：细胞自噬是机体内广泛存在的一种正常生理过程，在生理情况下很多细胞都可发生自噬。细胞经自噬可清除老化或受损的细胞器，并确保长寿蛋白质的正常周转。自噬也是机体在应对内环境的不良环境刺激下所表现出的一种防御机制，如：饥饿、缺氧或生长因子缺乏等应激状态，自噬可通过再生新陈代谢前体细胞及清除亚细胞碎片来维持细胞的完整性，这一过程既可以维持机体内环境的稳态平衡，也具有调控高等生物发育和相关疾病发展的重要意义。
机体内一般水平的自噬可保护细胞免受内环境刺激的影响，但自噬过度或低下都会形成自噬应激，造成细胞器损伤（如线粒体损伤和功能障碍等）和疾病的发生。当细胞自噬不足时，可引起细胞内受损细胞器及变性蛋白不能及时清除，破坏内环境稳态；当自噬过度时，可诱导自噬性细胞死亡，因为过度的自噬活动会导致胞质溶解和细胞器破坏，最终导致细胞功能丧失。如在心肌肥厚中，细胞自噬功能降低可使心肌肥厚加剧；在心力衰竭中，细胞自噬增强会导致心肌细胞自噬性死亡而致心功能持续降低。
近年研究发现，自噬参与许多生理病理发展进程。当机体发生感染时，细胞自噬能够降解细菌、病毒等微生物而增强免疫反应。此外，自噬通过下调干扰素对病毒感染的反应和促炎因子对入侵病原体的反应而抑制炎症[6]。再者，随着对细胞自噬研究的深入，自噬还参与清除在应激、衰老、疾病发展中因错误折叠而引起的多聚泛素化蛋白质聚合物的降解。此外，自噬也被认为与癌症、心脑血管疾病、帕金森病等神经系统疾病等密切相关。
2 衰老的机制及表现
细胞是构成生物体的基本结构和功能单位，机体老化常以细胞衰老为代表进行描述。细胞衰老，是正常细胞的必然归宿，最早用于描述在人二倍体成纤维细胞（human diploid fibroblasts，HDF），是机体在多因素作用下使细胞脱离细胞周期呈现“不可逆”停滞状态，最终表现为不可逆性丧失增殖能力。究其增殖能力丧失，是端粒缩短至Hayflick界限而触发DNA损伤。总之，衰老由多因素诱发，如自由基损伤、氧化应激、端粒缩短、DNA损伤和一些应激状态等。
细胞衰老有复制性衰老（replicative senescence，RS）和应激诱导的衰老（stress-induced senescence，SIS）两种类型。RS因端粒DNA缩短所致，SIS为应激诱发所致，如氧自由基（ROS）激活、致癌基因活化等。研究表明，致瘤性应激可诱发细胞衰老，即癌基因诱导的衰老（oncogene-induced senescence，OIS）。但迄今为止，单一性的细胞衰老标志仍未被发现。然而，随着衰老机制研究的深入，肿瘤抑制因子如p53、p16或Rb等，其调节途径蕴育衰老进程，作为衰老的标志现已被广泛认可，但对衰老进程的确切调节机制不明。为解释衰老表型的多样性，人们展开了深入研究，诸如线粒体DNA损伤反应、端粒缩短、表观遗传学调节、生物膜损伤，以及最近发现的自噬调节均参与了细胞衰老的调控。
3 细胞自噬与衰老的关联
经典的衰老观点认为，衰老是细胞对多种应激做出的一种反应，主要表现为细胞周期停滞、增殖能力下降、衰老相关基因表达增加，以及衰老细胞退行性改变和功能衰退。自噬，是应激状态下细胞呈现的一种防御保护生存机制，把自噬与应激反应紧密联系在一起的，即为细胞衰老。越来越多的研究显示，自噬现象广泛存在于机体的各种病理生理状态中，尤其与衰老关系密切。随着年龄的增长，自噬功能会逐渐减弱，而且自噬基因的功能丧失会导致机体寿命缩短，更有甚者，通过激活自噬功能来延长寿命。因此，细胞自噬已成为当前衰老与抗衰老研究的热点与潜在突破点。
3.1 衰老进程中可启动细胞自噬：已有大量文献显示出细胞自噬与衰老的关系，Young等[7]报道抑制细胞自噬可减轻原癌基因激活引起的细胞衰老；雷岳山[8]利用Ras诱导HDF的模型研究中，重现了OIS的动态过程，并且在Ras诱导的衰老细胞中观察到显著的细胞自噬活动，从而证实自噬在癌基因诱导的衰老中启动。再者，经自噬相关基因5（autophagy-related gene5， ATG5）、ATG8、ATG16研究得知，细胞自噬可直接引发细胞的OIS表型，并形成细胞衰老途径。再比如：限制饮食能延长酵母菌的时序寿命且能诱导MA，雷帕霉素抑制TOR激酶可延长酵母菌时序寿命且诱导MA，而ATG16变异的酵母菌进行饮食限制和雷帕霉素处理后并不能延长寿命[9]。此外，运动能够诱导骨骼肌细胞、心肌细胞等发生自噬[10]。郭献灵等[11]研究发现，缺营养会成为化疗不敏感肝癌細胞自噬的天然诱导剂。此外，细胞内、外环境改变所形成的刺激亦可启动细胞自噬，如细胞外pH的改变会影响细胞自噬活性[12]；Suk等[13]研究发现碱性环境可上调CHO、293T等细胞的自噬活性；Decuypere等[14]发现细胞内游离Ca2+升高可激活Ca2+/Ca MKKβ通路诱导自噬发生。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）在内外应激源刺激下所产生高表达HSP27的转基因小鼠心肌细胞自噬增强，可提高对心肌细胞老化的保护作用，改善老化心肌细胞收缩舒张功能障碍。细胞衰老的主要特征是因代谢产物的清除降低而引起受损蛋白过度累积，最终引起机体的生存能力降低[15]。启动细胞自噬达到抗衰老机制即为清除受损物质，实现能量循环利用，以及预防神经退行性病变、肿瘤等疾病的发生发展[16]。这说明细胞自噬极有可能是细胞衰老过程中的重要环节。
3.2 衰老进程中细胞自噬功能衰退：最新衰老机制研究显示，与年龄相关的细胞自噬功能衰减，从而导致衰老表现的观点已逐渐被接受，而且细胞衰老中变性蛋白质和受损细胞器的累积在衰老中的促进作用也被认可。研究显示，自噬功能的减退是造成衰老的首要原因，自噬机制受损与老年疾病（如帕金森病等）密切相关。在研究哺乳动物ATG6（真核生物称Beclin-1）、微管相关蛋白轻链3（LC3）及mRNA表达水平上调中发现，因衰老而减弱巨自噬及分子介导的CMA功能，可降低CMA效率，导致受损蛋白结合在溶酶体膜上及转运进入溶酶体的活动显著减弱。其CMA效率降低机制与衰老原因所造成溶酶体相关膜蛋白 2A（lysosomal-associated membrane protein 2A，LAMP-2A）的表达减少有关。细胞自噬功能降低会引起各器官功能衰退、机体老化及相关疾病发生。研究发现，衰老的人类大脑ATG5、Beclin1表达减少[17]；此外，在低等真核生物研究中发现，自噬已广泛作为抗年龄相关性衰老的效应因子并作为遗传学证据[18]。例如，在线虫中的研究发现，生理水平下自噬功能激活在延长寿命中是必需的，在胰岛素样信号通路下，DAF2功能缺失突变体线虫寿命缩短。另外，植物研究中也发现，剔除自噬基因ATG7、ATG4的拟南芥，可正常生长，但叶片衰老加快。此外，mTOR是自噬的负调控因子，雷帕霉素、白藜芦醇作为mTOR激酶抑制剂可延长生命晚期的实验小鼠平均寿命，且可观察到显著增强的自噬活动[19]。
3.3 增强细胞自噬功能可延缓衰老：最新研究表明，促进细胞自噬可延缓机体衰老，并非单是受损细胞器的降解和代谢废物的清理。通过增强细胞自噬功能可延长寿命、发挥抗衰老作用已在许多动物模型中得到证明。例如：在营养限制造成饥饿条件下可促进细胞自噬，从而实现了不同物种平均寿命的延长。这种促进细胞自噬的实验条件通常还有胰岛素的负性调节和抑制mTOR信号通路，此延长寿命的实验条件与自噬激活及功能增强是一致的。Pyo等[20]对小鼠进行转基因处理使其过表达自噬小体ATG5，达到中期寿命延长17.2%，且改善了衰老特征（如：体型消瘦、胰岛素敏感性提高、运动技能增强等）。自噬小体ATG5的增多使小鼠的抗衰老作用增强，其机制可能与变性蛋白或病原体清除增多、免疫应答增强、炎症反应降低等有关，从而使机体抵抗恶劣环境的能力增强。李丽等[21]证实，通过有氧运动训练上调老年小鼠心肌中Beclin-1和AGT7的表达，可显著改善衰老小鼠心肌收缩舒张能力。此外，当前激活自噬最重要的两种转录因子TFEB（transcriptionfactor EB）和FOXO（Forkhead boxclass O），通过直接激活自噬基因的表达而诱发自噬功能，实现延缓衰老和寿命延长。因此，通过诱导细胞自噬可延缓衰老并降低相关疾病已成为近年来关注的热点。
4 mTOR和AMPK信号通路在细胞自噬和衰老中的作用
伴随细胞水平上自噬对衰老调节认识的深入，科学家们进一步探讨了分子水平上自噬功能的调节，因此对信号通路有了一定认识。营养感应信号通路被认为是诱导细胞自噬功能发挥的重要途径之一。mTOR/TOR（target ofrepamycin）是自噬调节中非常关键的一个负调控因子，该因子由MTORC1和 MTORC2两种复合体组成。TOR激酶在复合体MTORC1中的作用主要是调控细胞生长、分化及自噬水平，在复合体MTORC2中主要调节细胞形态结构及功能代谢，起到间接调节自噬功能，两种复合体共同调控细胞衰老进程。复合体MTORC1经磷酸化使ULK/Atg1失活，达到抑制自噬。然而，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）经激活ULK/Atg1复合体而激活自噬功能。通过基因操控使衰老小鼠肝细胞表达LAMP-2A，可改善小鼠的CMA功能并维持细胞内环境稳态，增强衰老小鼠器官功能和对不同应力的抵抗，从而有效延长衰老动物的寿命。这种延长寿命的方法是通过CMA功能实现的，因此，CMA也是抗衰老的一个重要机制。此外，AMPK也是一种能量感应因子，在感应细胞内能量水平下调节细胞自噬[22]。mTOR和AMPK经蛋白磷酸化可调节细胞代谢与自噬水平，研究表明，抑制mTOR激酶信号通路、激活AMPK信号通路都能诱导细胞自噬来延缓衰老，延长生物体寿命。Decuypere等[14]研究发现，细胞内游离的Ca2+升高可激活Ca2+/Ca MKK β通路，后激活AMPK通路，诱导细胞自噬发生。
通过药物影响信号通路达到诱导细胞自噬、实现延缓衰老是当前的研究热点。自噬诱导剂如雷帕霉素（mTOR抑制剂）、白藜芦醇、组蛋白脱乙酰化激活剂等被认为具有抗衰老作用[19]；还有最近发现的抗衰老的自噬诱导剂，如：肌酸类似物胍基丙酸[23]和生物膜组成部分的前体乙醇胺[24]等。自噬诱导剂不仅具有抗衰老作用，在治疗癌症和神经退行性疾病中也具有较好的应用前景，部分已用于临床评估。然而，有些自噬诱导剂的作用机制尚不明确，如何更好、有针对性地调控细胞自噬以提高療效，还需深入研究。
5 p53在细胞自噬和衰老中的作用
衰老是细胞应对各种应激所表现的一种反应，以细胞周期停滞为主要表现。细胞自噬是机体在应激状态下所表现的一种防御性生存机制。p53是细胞自噬与衰老共同调控的关键蛋白，该蛋白位于多种调控网络关键节点。p53能够控制细胞周期，其机制是通过控制细胞周期G1向S期移行的控制点来发挥细胞周期调控。此外，p53在细胞的多种应激反应中具有极其重要作用。研究表明，p53可抑制mTOR信号通路，对细胞自噬和衰老发挥重要作用。如果干扰p53的表达，可减少衰老阳性细胞所占比例而促使衰老延迟，且干扰p53后的衰老细胞中自噬基因的表达显著降低。经转基因技术使携带有p53片段的转基因鼠因自噬抑制出现早老症状，对携带有完整p53基因和Arf的转基因鼠，因p53的适度表达表现为衰老延迟。同时位于p53下游的p21细胞衰老调控蛋白表达水平也相应下调，表明衰老可能与p21激活后阻止细胞调控点进而抑制细胞分裂程序达到阻断细胞增殖有关。总而言之，p53对细胞自噬的可能调节机制为：①p53可抑制mTOR信号通路激活自噬功能；②核内p53与自噬促进因子的基因启动子相结合，翻译表达AMPK、TSC2等诱发自体吞噬；③最近发现p53也能够激活ATG10和ATG7等自噬相关蛋白的表达。
6 中医中药调控细胞自噬延缓衰老的相关研究
中医多从“肾气”“阴阳调和”“气化”等方面来探讨自噬。中医认为，人体的衰老与“肾”密切相关，肾气盛则天癸至，肾气衰则天癸竭。所说之“肾”为广义，其既为生殖器官，又涵盖肾功能，“肾藏精，主生殖”即为此意。从功能看，肾为先天之本，元气之根，肾阴肾阳为人体阴阳的本源。中医认为自噬可“化精气”，具有改善衰老机体的气虚痰阻血瘀状态及平和阴阳之功[25]。因此，补肾益精，养血活血可延缓衰老，是治疗女性卵巢功能低下的根本大法。有学者发现在卵泡的整个发育过程中都有细胞自噬参与其中，因此自噬对女性的生殖功能具有重要作用[26]。
近年来，发现许多中药可明显促进自噬发生，尤其是补肾类中药在延缓衰老方面备受重视。从药理学看，补肾类中药在激素水平上主要调节机体H-P-G（下丘脑-垂体-性腺轴），从而调节促卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的分泌及调节中枢神经系统的功能，补肾中药可调节下丘脑-垂体-性腺功能，促使卵泡发育、排卵及改善黄体功能[27]。许多生物活性物质对自噬也有显著作用，如：白藜芦醇、南蛇藤素、姜黄素、芍药苷、β榄香烯、汉黄芩苷等。研究发现，白藜芦醇可保护心血管内皮细胞、心肌细胞，其机制可能与白藜芦醇激活环磷酸腺苷（cAMP），增加自噬相关基因 AGT3、LC3B表达，且可诱导内皮型一氧化氮合酶（eNOS）生成，以诱导细胞自噬发生[28]。另外，南蛇藤素可促进血管平滑肌细胞自噬，而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞中ROS 的产生和细胞衰老，其机制与南蛇藤素抑制PI3K/Akt/m TOR信号的蛋白表达及其磷酸化水平有关，从而保护心血管系统并延缓衰老[29]。经姜黄素处理后的血管内皮细胞LC3B蛋白上调、p62蛋白下调，且姜黄素处理后内皮细胞自噬体增加以降低氧化应激损伤所致的内皮损伤，通过自噬保护而延缓心脏衰老[30]。许志荣[31]在增生性瘢痕研究中发现，一定浓度的芍药苷可诱导成纤维细胞发生自噬，且经Western Blot检测成纤维细胞TIMP-2蛋白表达水平与芍药苷增加呈依赖性，其自噬机制可能与TIMP-2高表达有关。然而，当前中医药有关细胞自噬对衰老调节作用的研究尚处于起步阶段，其具体的作用机制尚不明确，如何将微观机制研究与传统的中医理论有机结合需做深入研究。
7 总结与展望
生命科学研究的深入使人类预期寿命延长，但有关衰老研究的具体问题面临诸多挑战。伴随生物分子、组织细胞及器官的慢性持续性损伤和功能减退，衰老机体易受疾病侵害而使死亡加速。细胞自噬能够帮助细胞抵抗恶劣应激条件，使受损细胞器降解，降解产物再用于合成细胞生存所需的蛋白质或损伤细胞的修复原料。自噬是维持真核细胞内稳态、实现细胞更新的一种重要进化机制。最新研究表明，衰老细胞病理生理的多方面改变与自噬功能密切相关，自噬在衰老进程中发挥着重要作用，细胞自噬功能增强可清除体内累积的衰老蛋白，成为细胞维持年轻的重要机制。而且，细胞自噬与衰老是细胞适应内外环境重要的调节机制，当前的研究提示细胞自噬可以调节细胞衰老进程，因此，利用细胞自噬来治疗某些衰老性疾病（如癌症、心脑血管病、神经退行性疾病等）必将成为未来医学研究的重点。但自噬影响衰老的确切机制及是否存在直接因果关系尚不清楚，有关自噬诱导剂的抗衰老效果需通过临床运用后进行评估。因此，对细胞自噬与衰老的关系及自噬影响衰老的作用机制需深入研究，不断发掘延缓衰老与衰老相关疾病治疗的新方法，以期延长人类寿命。
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