正交试验法优选潜阳育阴颗粒水提醇沉工艺-赤壁义工联盟巾帼志愿者赤壁热线探望随阳易家井雷郑湾受水灾群众8...

张芹++蒲维娅++钱芳

摘要：目的 优选潜阳育阴颗粒的水提醇沉工艺。方法 以二苯乙烯苷含量和干膏率的综合评分为指标，采用正交试验法，考察加水量、提取次数、提取时间对水提工艺的影响，考察水提液相对密度、醇沉浓度、静置时间对醇沉工艺的影响。结果 优选的水提工艺为：加12倍量水，提取2次，每次1 h；优选的醇沉工艺为：水提液浓缩至相对密度1.10（60 ℃），醇沉浓度60%，静置48 h。结论 优选的工艺稳定可行，可用于该制剂的工业化生产。

关键词：潜阳育阴颗粒；水提醇沉；正交试验；二苯乙烯苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.025

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0103-04

Optimization of Water Extraction and Alcohol Precipitation Technology for Qianyang Yuyin Granules by Orthogonal Test ZHANG Qin， PU Wei-ya， QIAN Fang （Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

Abstract： Objective To optimize water extraction and alcohol precipitation technology for Qianyang Yuyin Granules. Methods With composite score of the content of stilbeneglycoside and dry extract yield as indexes， effects of the amount of water， extraction times and time on extraction technology were investigated by orthogonal test； the effects of relative density of concentrated liquid， the concentration of alcohol precipitation and standing time on alcohol precipitation technology were also investigated. Results Optimum extraction process was as following： extracting 2 times with 12 times the amount of water， 1 hour each time； Optimum alcohol precipitation technology was as following： the relative density of concentrated liquid 1.10 （60 ℃）， the concentration of alcohol precipitation 60%， standing time 48 hours. Conclusion The optimum method is stable and feasible， which is suitable for industrial production of the preparation.

Key words： Qianyang Yuyin Granules； water extraction and alcohol precipitation； orthogonal test； stilbeneglycoside

潜阳育阴颗粒为本院院内制剂，由制何首乌、鬼针草、山萸肉、川牛膝等6味中药组成，具有补益肝肾、活血通络的功效。本试验综合考虑与功能主治相关的主要有效成分理化性质，并结合临床用药基础、水溶性颗粒剂成型需要，以二苯乙烯苷含量和干膏率的综合评分为评价指标，优选水提及醇沉工艺，为该制剂的规范化生产提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100液相色谱仪，包括四元泵（G1311A）、柱温箱（G1316A）、VWD检测器（G1314A）、工作站（Chemstation）；BP-211D型十万分之一电子分析天平，德国Sartorius；KQ-1000E医用超声波清洗器，昆山超声仪器公司；101-1A电热鼓风干燥箱，南通

通讯作者：蒲维娅，E-mail：pwy1974@126.com

沪通制药设备厂；HH-4数显型恒温水浴锅，金坛荣华仪器制造公司；Millipore-Q纯水机，美国Millipore公司。

二苯乙烯苷对照品（批号110844-201006，含量测定用），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，乙醇为分析纯。制何首乌、鬼针草等饮片购于江苏省药材公司，由江苏省中医院刘志辉主任药师鉴定，符合2015年《中华人民共和国药典》各药材项下规定。

2 方法与结果

2.1 二苯乙烯苷含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hedera C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（19∶81）；检测波长：320 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL[1]。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取二苯乙烯苷对照品17.90 mg，加稀乙醇溶解，制成每1 mL含二苯乙烯苷0.179 mg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备 精密吸取样品2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加稀乙醇，超声（功率280 W，频率50 Hz）20 min，放冷，再加稀乙醇至刻度。摇匀，过滤，取续滤液，即得。取不含制何首乌的阴性样品，同法制得阴性对照溶液。

2.1.4 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，供试品与对照品在相同位置有较大吸收，阴性对照无干扰。二苯乙烯苷峰与相邻峰的分离度>1.5。色谱图见图1。

2.1.5 线性关系考察 取“2.1.2”项下对照品溶液，用稀乙醇分别稀释为89.5、44.75、22.375、11.187 5、5.593 8、2.796 9、1.398 4 μg/mL的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，经线性回归，得二苯乙烯苷回归方程Y=4107.1X-37.689，r=0.999 9，二苯乙烯苷进样量在0.013 98～1.79 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 精密吸取二苯乙烯苷对照品溶液，注入液相色谱仪，重复进样6次，以峰面积计算，RSD=0.75%。

2.1.7 重复性试验 精密吸取同一样品2 mL，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定，以二苯乙烯苷含量计算，RSD=1.82%（n=6）。

2.1.8 稳定性试验 取样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，放置0、2、4、6、8、12 h，进样，记录色谱峰面积，RSD=1.13%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 精密吸取已知含量的同一样品6份，加入二苯乙烯苷对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算二苯乙烯苷含量，结果平均回收率为98.48%，RSD=1.04%。

2.2 水提工艺优选

2.2.1 水提工艺因素水平的确定 根据预试验结果，以影响水提的主要因素提取时间（A）、提取次数（B）、加水量（C）为考察因素[2]，采用L9（34）进行正交试验，因素水平见表1。

2.2.2 水提工艺干膏得率 精密吸取样品2 mL，水浴蒸干，置105 ℃烘箱3 h，取出，再置干燥器冷却30 min，立即称重。

2.2.3 水提工艺正交试验 称取处方量饮片96 g，采用L9（34）正交试验，测定提取液中二苯乙烯苷量和干膏得率。二苯乙烯苷量为主要指标，干膏得率为次要指标，权重系数分别定为0.7、0.3。综合评分=二苯乙烯苷量÷最大二苯乙烯苷量×100×0.7+干膏得率÷最大干膏得率×100×0.3，以综合评分作为筛选指标。试验结果见表2、表3。

由正交试验及方差分析结果可知，因素B对试验结果有显著影响，因素A、C对试验结果无显著影响，各因素的影响次序为B>C>A，各因素不同水平影响次序为A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2，因此最佳提取工艺为A2B3C3，即加12倍量水，提取3次，每次1 h。考虑到工业生产的实际，优选提取工艺为A2B2C3，即加12倍量水，提取2次，每次1 h。

2.2.4 水提工艺验证试验 称取处方量饮片96 g，共3份，按优选的工艺提取，结果见表4，表明优选的水提工艺稳定可行。

2.3 醇沉工艺优选

2.3.1 醇沉工艺因素水平的确定 根据文献[3]和预试验结果，以影响醇沉的主要因素醇沉浓度（A）、水提液相对密度（B）、醇沉时间（C）为考察因素，选用L9（34）进行正交试验，因素水平见表5。

2.3.2 醇沉工艺正交试验 称取处方量饮片96 g，按优选水提取工艺制备水煎液。采用L9（34）正交试验，按“2.2.3”项下方法计算综合评分，以综合评分作为筛选指标，试验结果见表6、表7。

由醇沉工艺正交试验和方差分析结果可以看出，因素A、B、C对试验结果均无显著影响，各因素影响次序为B>C>A，各因素不同水平的影响次序为A1>A3>A2、B1>B2>B3、C3>C2>C1，最佳醇沉工艺为A1B1C3，即水提液浓缩至相对密度1.10（60 ℃），醇沉浓度60%，放置48 h。

2.3.3 醇沉工艺验证试验 称取处方量饮片96 g，共3份，按优选水提工艺制备水煎液，测得二苯乙烯苷量为82.04 mg，转移率为59.71%，再按优选的醇沉工艺试验，结果见表8，表明此醇沉工艺稳定可行。

3 讨论

为了便于服用和保持原方疗效，选择将潜阳育阴颗粒采用水提醇沉工艺提取。以二苯乙烯苷含量和干膏率的综合评分为指标，通过L9（34）正交试验法优选水提和醇沉工艺参数。

中药水提液杂质较多，如淀粉、树脂、果胶、黏液质等。目前常用除杂方法有：乙醇沉淀法、板框压滤法、高速离心法、吸附澄清法等[4-10]。吸附澄清法近年使用比较多，主要除去蛋白质、淀粉等胶体不稳定成分，对多糖、氨基酸、维生素、多肽等无影响，此法实际操作中工序多，加入澄清剂搅拌后，仍需离心，故成本较高。高速离心为物理分离方法，大生产中药液产量大，用高速离心除杂必然增加资产投资。乙醇沉淀法为中药口服制剂精制的最常用方法，能获得较好的除杂效果。

据文献报道，液体状态的二苯乙烯苷在高温条件下不稳定，随着温度的升高，二苯乙烯苷质量浓度减小的速率增快，60 ℃及以下温度对二苯乙烯苷质量浓度影响较小[11]。潜阳育阴颗粒醇沉前处方量饮片中二苯乙烯苷量为82.04 mg，转移率为59.71%；醇沉后处方量饮片中二苯乙烯苷量为44.68 mg，转移率为32.52%。为减少由醇沉引起的二苯乙烯苷损失，醇沉液采用减压回收乙醇并减压浓缩以控制温度。本结论也提示，含二苯乙烯苷的制剂在制备过程中应尽量避免高温，尤其是在浓缩、干燥过程中应尽量保持温度在60 ℃以下。

本试验参考药典[1]，以乙腈-水（25∶75）为流动相，结果二苯乙烯苷未能有效分离，通过调整流动相比例，以乙腈-水（19∶81）为流动相，结果分离效果佳，保留时间适度。因此，确定其为二苯乙烯苷含量测定的流动相。根据试验结果及生产实际，确定了潜阳育阴颗粒水提醇沉最佳工艺。验证试验结果表明，优选的水提醇沉工艺稳定、合理、可行。

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（收稿日期：2015-12-23）