小鼠血浆中白藜芦醇含量测定及药动学研究梁力

曾洁 华丽萍 黄彬 张玉琴 徐伟 林羽

摘要：目的 建立測定大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷含量的高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）方法，并用于研究其在大鼠体内的药动学特征。方法 采用HPLC-MS/MS方法，色谱柱为Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（30∶70，V/V），流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 ?L，检测波长230 nm；定量离子对为：m/z 525→120.9（芍药苷和芍药内酯苷）、m/z 433→224.8（内标物栀子苷）。8只雄性SD大鼠，给予6 g原药材/kg白芍汤灌胃，分别于0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL，测定血药浓度，采用DAS V2.1.1药动学软件计算其主要药动学参数。结果 芍药苷和芍药内酯苷分别在40～8000 ng/mL和40～10 000 ng/mL范围内线性关系良好（r值分别为0.999 6和0.999 5），日内和日间精密度RSD均小于6%，提取回收率分别为92.33%～95.43%和88.65%～95.62%，基质效应分别为99.29%～107.86%和93.79%～104.05%，方法学考察均符合要求。主要药动学参数：芍药苷、芍药内酯苷Cmax分别为（8.50±2.01）、（4.13±0.72）?g/mL，tmax分别为（10.00±1.73）、（20.00±2.11）min，t1/2分别为（142.98±30.11）、（127.68±35.74）min。结论 本研究所建立的HPLC-MS/MS方法简单可行、准确可靠、灵敏度高、专属性强，可应用于研究与分析芍药内酯苷和芍药苷在大鼠体内的药动学特征。

关键词：高效液相色谱-质谱联用；芍药苷；芍药内酯苷；药动学；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0089-06

Study on Content Determination and Pharmacokinetics of Paeoniflorin and Paeonolide

from Paeoniae Radix Alba in Rat Plasma

ZENG Jie1， HUA Li-ping2， HUANG Bin1， ZHANG Yu-qin2， XU Wei2， LIN Yu2

1. National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pharmacy College of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China

Abstract： Objective To establish a method for the content determination of paeoniflorin and paeonolide in rat plasma by HPLC-MS/MS； To study its characteristics of pharmacokinetics. Methods HPLC-MS/MS method was adopted. The column was Ultimate RXB-C18 （2.1 mm×100 mm， 3 ?m） with mobile phase consisted of acetonitrile- 0.1% formic acid water solution. Flow rate was 0.3 mL/min； column temperature was 30 ℃； the volume was 5 ?L； detection wavelength was 230 nm. Quantitative ions were m/z 525→120.9 （paeoniflorin and paeonolide）， m/z 433→224.8 （geniposide）. 8 SD male rats were collected blood 0.5 mL from orbital vein 0， 5， 10， 20， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 360， 540， 720 min after intragastric administration Baishao Decoction 6 g （medicinal materials）/kg to determine the blood concentration of medicine. DAS V2.1.1 software was employed to calculate pharmacokinetic parameters. Results Good linearity was found in the range of 40–8000 ng/mL and 40–10 000 ng/mL for paeoniflorin and paeonolide （r=0.999 6， r=0.999 5）. The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. The extraction recoveries were 92.33%–95.43% and 88.65%–95.62%. The matrix effect values were 99.29%–107.86% and 93.79%–104.05%.

All items of method validation were in line with the requirements. The main pharmacokinetic parameters of paeoniflorin and paeonolide were showed as follows： Cmax of （8.50±2.01） and （4.13±0.72） ?g/mL； tmax of （10.00±1.73） and （20.00±2.11） min； t1/2 of （142.98±30.11） and （127.68±35.74） min. Conclusion The HPLC-MS/MS method established in this study is simple， feasible， accurate， reliable， highly sensitive， and specific， which can be applied to study the pharmacokinetic characteristics of paeoniflorin and paeonolide in rats in vivo.

Keywords： HPLC-MS/MS； paeoniflorin； paeonolide； pharmacokinetics； rats

白芍含有多種化学成分，具有多种药理作用，其有效部位白芍总苷被开发为胶囊制剂（商品名为帕夫林），作为抗炎免疫调节药应用于临床[1]。芍药苷和芍药内酯苷为白芍中含量较高的2个活性成分（其中芍药苷占白芍总苷的90%以上）[2]。芍药内酯苷具有抗癫痫、镇痛、解毒及止眩晕等作用[3]，芍药苷具有神经保护、生血和扩张血管等作用[4]。

有关芍药苷和芍药内酯苷的药动学研究已有较多文献报道，但研究主要着重于单体化合物[5-7]，以中药煎煮方式制备并观察给药后其体内药动学研究较少。本研究以芍药苷和芍药内酯苷为白芍代表性有效成分，建立高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）测定灌胃给药白芍煎煮液后大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷含量的方法，阐明其药动学特征。

1 仪器、试药与动物

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent 6410三重四级杆质谱联用仪（美国Agilent公司），微型涡旋混合仪（其林贝尔仪器制造有限公司，VORTEX-5），高速离心机（美国贝克曼，Microfuge 22R），微量移液器（德国Eppendorf公司），十万分之一天平（METTLER TOLEDO）。

芍药苷对照品（批号110736-201033，纯度95.7%），中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷对照品（批号39011-90-0，纯度98%），成都曼思特生物科技有限公司；栀子苷对照品（批号110749-201127，纯度97.5%），中国食品药品检定研究院。白芍饮片（批号20120808），福州回春中药饮片厂有限公司。乙腈（色谱纯，美国默克公司），甲酸（色谱纯，德国Merck公司），其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

8周龄清洁级健康SD雄性大鼠24只，体质量（280±20）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物房。

2 方法与结果

2.1 液相色谱及质谱条件

液相色谱条件：色谱柱为Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），检测波长230 nm，流动相为乙腈-0.1%甲酸水（30∶70，V/V），等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 ?L。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），干燥气体为N2（纯度99.9%），干燥气流量15 L/min，负离子检测模式，毛细管电压2.5 kV，离子源温度350 ℃，采集方式为多反应监测（MRM），定量离子对为m/z 525→120.9（芍药内酯苷和芍药苷）、m/z 433→224.8（内标物栀子苷）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 白芍汤制备

称取白芍饮片，10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，过滤，合并2次药液，减压浓缩药液并用超纯水定容至1 g原药材/mL，供动物实验用。

2.2.2 对照品溶液及内标溶液的制备

精密称定适量对照品芍药苷和芍药内酯苷，加入甲醇，分别制得浓度为800 ?g/mL的对照品母液。另取一50 mL量瓶，移取上述对照品母液各1 mL，加入甲醇定容至刻度，即得含有16 ?g/mL芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品贮备液。稀释得所需不同浓度的芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品溶液。精密称定栀子苷适量，加入甲醇，定容得3 mg/mL的内标母液，稀释得浓度为30 ?g/mL的栀子苷溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存。

2.2.3 血浆样品的制备

大鼠随机分为给药组、对照组与空白组，每组8只。给药组大鼠实验前禁食12 h，自由饮水，按6 g/（kg·d）剂量灌胃给药；对照组和空白组给予等剂量生理盐水灌胃。给药组大鼠于灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL并立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5 min，4000 r/min离心10 min，分别取血浆，置于-20 ℃冰箱中保存待测。对照组与空白组大鼠于灌胃后5 min取血，离心后得空白血浆，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

各组分别取50 ?L血浆，加50 ?L内标物（30 ?g/mL栀子苷甲醇溶液），给药组和空白组加入100 ?L纯甲醇，对照组分别加入“2.2.1”项下不同浓度的混合对照品溶液100 ?L（配制成不同浓度芍药内酯苷、芍药苷的血浆质控样品），涡旋2 min，以12 000 r/min离心10 min沉淀蛋白后，取上清液150 ?L，放入1.5 mL EP管内，减压离心浓缩仪浓缩，温度调至45 ℃左右。挥干后，各组样品用150 ?L纯甲醇复溶，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，17 000 r/min离心10 min，移出100 ?L于全回收进样瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

分别取空白组、对照组和给药组血浆样品（给药后10 h），进样测定，HPLC-MS/MS图见图1，表明血浆中的内源性物质不干扰测定。

2.3.2 线性范围考察与最低定量限

取对照组大鼠血浆，按“2.2.3”项下方法配制成相当于芍药苷、芍药内酯苷血浆浓度为0.04、0.08、1、2、4、8 ?g/mL的血浆样品，进样5 ?L，记录色谱图。分别以芍药内酯苷、芍药苷的待测血浆浓度为横坐标，以待测峰面积与内标物质的峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法求得直线回归方程，并计算最低定量限，结果见表1。

2.3.3 精密度和标准曲线准确度试验

取沉淀蛋白后的空白组大鼠血浆50 ?L，分别制备芍药苷、芍药内酯苷低、中、高3个浓度的质量控制（quality control，QC）样品和随行的标准曲线，按“2.2.3”项下方法操作，进样5 ?L，记录色谱图。每批每个浓度平行制备6份样品，分3 d重复测定3批，并与标准曲线同时进行。用随行的标准曲线计算各QC样品的浓度，经方差分析求得本法的精密度；并用QC样品浓度的测定值与理论值的百分比表示准确度，结果见表2。结果表明，所建立的测定血浆中芍药苷、芍药内酯苷浓度的分析方法符合要求，可用于体内测定。

2.3.4 穩定性试验

取空白组大鼠血浆，沉淀蛋白后，吸取上清液，制备得芍药苷和芍药内酯苷浓度为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，每个浓度样品平行制备6份，分别在室温和4 ℃环境下放置24 h、反复冻融3次（-80 ℃冷冻，室温解冻），考察样品的稳定性，之后按“2.2.3”项下方法操作，进样测定峰面积，与当日所制备标准曲线计算值之比为结果，见表3。结果表明，芍药苷和芍药内酯苷在上述环境下RSD均小于6%，稳定性良好。

2.3.5 提取回收率及基质效应

取经沉淀蛋白后的空白组大鼠血浆150 ?L，加入等体积不同浓度的芍药苷和芍药内酯苷混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，挥干后150 ?L甲醇复溶、离心，制成浓度分别为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，每个浓度平行制备6份样品，进样，得峰面积A，相同质量浓度的对照品溶液进样测定得峰面积B。基质效应（%）=（A/B）×100%。取对照组大鼠血浆，按“2.2.3”项下方法制备芍药苷和芍药内酯苷浓度为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，进样测定，得峰面积C。提取回收率（%）=（C/A）×100%。结果见表4。结果表明，芍药苷和芍药内酯苷不存在明显的基质效应（芍药苷为93.79%～104.05%，芍药内酯苷为99.29%～107.86%，RSD均小于9%），提取回收率符合要求（芍药苷为88.65%～95.62%，芍药内酯苷为92.33%～95.43 %，RSD均小于12%）。

2.4 大鼠体内药动学研究

SD雄性大鼠8只，灌胃给药前禁食12 h，自由饮水。按6 g/（kg·d）剂量灌胃给药，灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL，采集大鼠血浆，用经方法学验证的HPLC-MS/MS方法定量分析血浆中芍药苷和芍药内酯苷的浓度，绘制血药浓度-时间曲线，结果见图2、图3。采用DAS V2.1.1药动学软件计算其主要药动学参数，结果见表5。芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的血药浓度达峰时间tmax分别为10.00、20.00 min，半衰期t1/2z分别为142.98、127.68 min。表明芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的吸收和消除速率均较快。

3 讨论

本研究旨在探讨芍药苷和芍药内酯苷这2种白芍专属化学成分在大鼠体内的药动学性质，精确阐述这2种指标成分的体内代谢过程，从而为白芍的进一步临床应用提供实验依据。为了更加接近传统中药方剂的用药习惯，本试验采用煎煮法对白芍饮片进行提取，提取溶剂选择水，并用干扰杂质更少的超纯水代替一般用水。

血浆样品前处理中，选择去除血浆蛋白方式时，由于芍药苷和芍药内酯苷同为水溶性物质，极性较大，因此，如果采用液-液萃取的方式除去蛋白，芍药苷和芍药内酯苷的提取率较低。由于眼眶静脉取血单次取血量少（0.5 mL），故不适合使用固相萃取柱净化法去除血浆蛋白。最终，本研究采用操作简单的有机溶剂沉淀法，分别考察了甲醇和乙腈2种蛋白沉淀剂，结果表明，甲醇较乙腈更能均匀去除血浆蛋白，色谱响应较高，因此选用甲醇沉淀血浆蛋白。

选择流动相和质谱条件时，由于芍药苷与芍药内酯苷的母离子和子离子完全一样，如果色谱上未能完全分离，则会影响后续的质谱检测，因此，本研究对液相色谱中流动相进行了考察。经对比发现，甲醇体系分离度较乙腈体系差，并且存在色谱峰拖尾造成的不对称问题，加入一定量的甲酸能够改善其峰形。因此，最终选择乙腈-0.1%甲醇作为流动相，其分离度较甲醇体系好，质谱响应也明显优于乙腈-水体系。针对芍药苷和芍药内酯苷的化学结构和理化性质，负离子检测模式更能提高化合物的响应，此外再采用MRM模式。由于四级杆质谱分子量偏差一般较大，故本研究通过对所分析化合物的碰撞裂解碎片推测分析，采用Masslynx V4.1的精确分子量工具计算，最终确定待测物的质谱条件。

大鼠灌胃给药白芍汤后，芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的消除过程均属于一级消除，药动学模型符合二室模型要求。观察其药动学参数可知，芍药苷和芍药内酯苷的表观分布容积/绝对生物利用度（Vz/F）均大于SD大鼠体液体积（0.6～0.7 L/kg），这与弱碱性药物分布容积较大的特点一致。芍药苷的tmax为（10.00±1.73）min，t1/2为（142.98±30.11）min；芍药内酯苷的tmax为（20.00±2.11）min，t1/2为（127.68±35.74）min。表明芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内能够被迅速吸收，达到峰浓度后也能够迅速消除。白芍汤灌胃给药吸收速度快，同时吸收程度较低，提示芍药苷和芍药内酯苷可能主要经上消化道吸收，对白芍相关制剂的开发和给药途径的选择具有一定的指导意义。与同类型文献相比，其达峰时间较快、末端消除半衰期则有所延长[8-10]，这种差异可能是由灌胃剂量的不同或药物的配伍作用引起的；但与一些复方制剂的药动学研究[11-12]相比，发现白芍与其他中药配伍（如当归、甘草）可以显著增加芍药苷和芍药内酯苷的达峰时间以及末端消除半衰期，延长其在体内的滞留时间。另外，本研究中，芍药苷和芍药内酯苷的药物浓度-时间曲线均出现双峰现象。导致双峰的原因很多，如肝肠循环和其他循环过程（胃-肠循环、肠-肠循环等）或者胃排空延迟、药物在肠段不同部位吸收的差异等。关于芍药苷、芍药内酯苷出现双峰的具体原因需要进一步研究。

本研究建立了同时检测大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷的HPLC-MS/MS方法，该方法灵敏度高、专属性强、准确可靠，可应用于研究与分析芍药内酯苷和芍药苷在大鼠体内的药动学特征，具有较好的临床应用价值。

致谢：本课题在福建中医药大學康复技术协同创新中心和国家中医药管理局中医康复研究中心资助下完成。

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