的分析BMP2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响.pdf文档...
李书坛 黄纯兰
[摘要] 目的 研究BMP-2联合人骨髓间充质干细胞（MSC）造血干细胞（HSC）体外增殖的影响。 方法 培养MSC至第三代，磁珠分选仪分选HSC，并用流式细胞术鉴定MSC与HSC。将获得的MSC与HSC利用Transwell非接触共培养，100 ng/mL的骨形态发生蛋白（BMP-2）干预，即实验分四组：HSC组、HSC+BMP2组、HSC+MSC组、HSC+MSC+BMP2组。培养3 d后比较不同培养条件下HSC计数、RNA浓度的不同，并通过实时荧光定量PCR法及免疫荧光方法检测HSC的Ki67的mRNA及蛋白的表达。 结果 HSC的计数、总RNA含量、Ki67的表达在HSC+BMP2组高于HSC组、HSC+MSC组高于HSC组、HSC+MSC+BMP2组高于HSC+MSC组（P < 0.05）。 结论 MSC协同BMP-2蛋白可促进HSC的增殖。
[关键词] 造血干细胞；间充质干细胞；BMP-2；增殖
[中图分类号] R331.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（c）-0004-05
The effect of bone marrow mesenchymal stem cell synergistic BMP-2 in the proliferation of hematopoietic stem cell
LI Shutan HUANG Chunlan
Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Southwestern Medical University， Sichuan Province， Luzhou 646000， China
[Abstract] Objective To explore the proliferation effect of bone morphogenetic protein （BMP）-2 on hematopoietic stem cell （HSC） cocultured with mesenchymal stem cell （MSC）. Methods MSCs were expanded to the third passage （P3） in the plastic dish； CD34+ cells were sorted by MACS Miltenyi Biotec. MSCs（P3） and HSCs were identified by FCM separately， and then MSC （P3） and HSC were co-cultured in the Transwell interfered with BMP-2 protein， four groups in the study： HSC group， HSC+BMP2 group， HSC+MSC group， HSC+MSC+BMP2 group. Cells were collected after 3 d to test HSC proliferation using the following methods：counting of the number， detecting of the total RNA， the mRNA and protein expression of Ki67 were detected by fluorescence qRT-PCR and immunofluorescence methods. Results The number of HSC， totel RNA， Ki67 expression of the HSC+BMP2 group was higher than HSC group， HSC+MSC group was higher than HSC group， HSC+MSC+BMP2 group was higher than HSC+MSC group （P < 0.05）. Conclusion MSCs synergistic with BMP-2 can enhance MSC proliferation effect on HSC.
[Key words] Hematopoietic stem cell； Mesenchymal stem cell； BMP-2； Proliferation
造血干细胞（hematopoietie stem cells，HSC）自我更新及多向分化等生理过程都离不开其生存的微环境增殖。骨髓基质细胞及其前体间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）以及它分泌的黏附分子、細胞因子和细胞外基质形成复杂的信号网络，它们共同构成的微环境即微龛“niche”调控着HSC的增殖等。从微环境的角度研究MSC对HSC的增殖作用及其机制是当前的研究热点[1-3]。BMP-2蛋白是多功能蛋白，可直接参与造血的调控，对造血表现出抑制、促进[4-5]等作用，此外BMP-2能促进新骨的形成，同时新生出血管。已有大量研究证实MSC对HSC具有增殖作用[6]，其依赖于细胞直接接触间的相互作用、分泌的细胞外基质和细胞因子[7-8]，且接触比非接触共培养具有更强的扩增作用[9]。本研究利用Transwel的上室底部网板微孔直径仅0.4 μm，使得上室的HSC不能进入下室，排除了细胞间直接接触对HSC增殖的影响，但细胞分泌的细胞因子可以通过该微孔，利于探讨这种作用可能是通过MSC分泌的细胞因子促进了HSC的增殖。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
LG-DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；鼠抗人ECD-CD34、PEcy7-CD45、FITC-CD105、IgG抗体（美国Pharminge公司）；鼠抗人FITC-Ki67抗体（上海雷浩信息科技有限公司）；干细胞因子（stem cell factor，SCF）、白介素-3（interleukin-3，IL-3）（美国Peprotech公司）；重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）（RD公司）；流式细胞仪（美国BECKMAN公司），Mini MACS免疫磁性吸附柱分离装置和CD34+细胞选择试剂盒（德国Mitenyi Biotec公司）；反转录试剂盒（日本TOYOBO公司），PCR试剂盒（德国QIAGEN公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）；引物：β-actin上游AGAGATGGCCACGGCTGCTT，下游ATTTGCGGTGGACGTGGAG，Ki67上游CAAGCCACA？鄄GTCCAAGAGAA，下游GTGTCCATAGCTTTCCCTAC？鄄TG（上海生工生物工程股份有限公司）；Transwell小室（美国Costar公司）；PCR仪（罗氏公司）；荧光显微镜（罗氏公司）等。
1.2 方法
1.2.1 间充质干细胞的培养和鉴定
取年龄20～45岁健康正常人髂骨骨髓液（经医院伦理委员会批准及取得供者知情同意），与完全培养基按体积比为1∶4混合后于37℃、5%CO2孵箱中培养（完全培养基成分为89%LD-DMEM+10%胎牛血清+1%青-链霉素）。3 d换液1次，细胞融合达80%用0.25%胰蛋白酶消化1∶2传代，传至第三代（P3）备用，流式检测MSC表面抗原CD105、CD34-ECD及CD45。
1.2.2 CD34+细胞的分选及纯度鉴定
用Ficoll分选骨髓液中单个核细胞，根据miniMACS免疫磁性吸附柱分离装置，用CD34+细胞选择试剂盒按照其说明进行CD34+细胞的分离。流式检测所分选细胞的纯度。
1.2.3 共培养
实验分四组，HSC组：HSC单独培养，HSC+BMP2组：HSC添加BMP-2蛋白，HSC+MSC组：HSC种于Transwell上室、MSC种于下室，HSC+MSC+BMP2组：共培养并添加BMP-2，每组4复孔。CD34+细胞1.0×105个/孔，MSC 3.0×106个/孔，rhBMP-2浓度为100 ng/mL，每孔总体积700 μL（89%IMDM+10%胎牛血清+1%青-链霉素，IL-3浓度10 ng/mL、SCF50 ng/mL）。重复3次。
1.2.4 检测HSC的增殖情况
培养72 h后收集HSC，流式细胞仪检测HSC的表面抗原CD34的表达情况；计数板计数造血干细胞的数目，Trizol法提取HSC的RNA并用紫外线分光光度仪测其浓度，实时荧光定量PCR法检测其Ki67 mRNA的表达；细胞经多聚甲醛固定，破膜，封闭，FITC标记的Ki67抗体孵育，洗涤等处理后，荧光显微镜观察Ki67在细胞核内的表达。重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 分选出的细胞的生物学鉴定
2.1.1 间充质干细胞
2.1.1.1 原代培養72 h可见散在的梭形贴壁细胞，第14天细胞融合度可达80%～90%，排列成放射状、漩涡转。P3代细胞在24 h内大多能贴壁。见图1。
2.1.1.2 流式鉴定第三代MSC的CDl05、CD34、CD45表达，MSC表达非造血相关免疫标记CDl05，不表达造血相关免疫标记CD34、CD45。见图2。
2.1.2 造血干细胞
经磁珠分选后的CD34+细胞呈大小均一的小圆形，经胎盘兰染色后98%细胞拒染。流式细胞仪检测经磁珠分选后的CD34+细胞的纯度为86.3%。
2.2 共培养第3天各组HSC的免疫表型
共培养3 d收集各组HSC，流式检测其表面抗原CD34的表达，各组HSC仍高表达CD34，均高于80%。见图3。
2.3 共培养第3天各组HSC的增殖比较
2.3.1 细胞计数及荧光定量PCR
HSC的细胞计数、总RNA及增殖活性基因Ki67的表达在HSC+MSC+BMP2组高于HSC+MSC组，HSC+MSC组高于HSC组，HSC+BMP2组高于HSC组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
2.3.2 Ki67免疫荧光
FITC标记的Ki-67在各组HSC上表现为片状翠绿色荧光，显示Ki-67蛋白的分布基本覆盖整个细胞核。且可以看出Ki67荧光强度在HSC+MSC+BMP2组高于HSC+MSC组，HSC+MSC组及HSC+BMP2组高于HSC组。见图4（封三）。
3 讨论
全骨髓贴壁法是目前培养间充质干细胞的重要方法之一，有操作简便、所培养出的细胞活性高等优点。我们采用该方法培养出的MSC具有贴壁生长的特性，其生长特点与文献报道的相符合[10-11]，表达非造血相关免疫标记CD105，而不表达造血相关免疫标记CD34和CD45，且在前期的实验中本课题组已对其成骨、成脂能力进行鉴定[12]。CD34仍然是目前公认的分选造血干细胞的主要免疫标记，本研究应用免疫磁珠法分选出的CD34+造血干细胞的纯度及活性高。
Ki67基因与细胞增殖相关，其表达的核蛋白，与核糖体RNA转录相关，在增殖期细胞表达，静止期细胞不表达。Ki67的阳性率越高，细胞增殖越活跃。本研究应用PCR法及免疫荧光两种方法检测Ki67在不同组中的表达，以比较HSC的增殖能力。此外，细胞数目的增加及增殖能力的增强可伴有总RNA增加。故本研究选用细胞计数、总RNA、Ki67来评估不同干预条件下HSC的增殖能力，并且发现BMP-2和/或MSC可以促进HSC增殖，且增殖后的HSC经流式细胞学鉴定仍高表达CD34。
本实验应用Transwell将MSC与HSC进行非接触共培养，根据结果发现MSC可以促进HSC增殖，这可能是MSC分泌了相关的活性物质经Transwell的下室穿过Transwell的网膜进入上室，促进HSC增殖。BMP/TGF-β家族对HSC的调控作用很复杂，且与特定环境的精细调控相关[13-15]。BMP-2对HSC增殖的影响与HSC培养的时间及模式、BMP-2的浓度以及所联合的细胞因子种类等具体的环境相关[13-16]。本研究发现培养3 d浓度为100 ng/mL的BMP-2有促进HSC增殖的作用。rhBMP-2在体外和体内均能促进MSC的增殖[17]，并能促进MSC分泌造血生长因子，如IL-6、IL-11、G-CSF和SCF等。根据本研究，BMP-2协同MSC较MSC单独对HSC的增殖作用更强，说明BMP-2协同MSC对HSC有增殖作用，由此推测这种增殖作用可能是BMP-2促进MSC分泌了促HSC增殖的相关因子。
研究表明[18]BMP信号通路可通过成骨niche，也可能通过血管niche调控造血[19]。与前者相比，血管niche能促进HSC增殖、分化[20]。本研究发现的BMP-2协同MSC对HSC的增殖作用是否是通过促进血管形成相关物质的表达相关，在下一步实验中我们将继续探讨。
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（收稿日期：2018-00-00 本文編辑：任 念）
