...口愈合过程中可作用皮下结缔组织等,平衡组织细胞的均匀分裂增...
徐万田 陈韵 林楠 唐玉香 闫翔
[摘要]目的：研究TGF-β1對牙髓细胞增殖、分化和ERK/MAPK信号通路的影响。方法：采用Western blot检测TGF-β1在急性牙髓组织、慢性牙髓组织和正常牙髓组织中的表达，然后采用Ⅰ型胶原酶消化分离培养牙髓细胞，不同浓度的TGF-β1处理牙髓细胞7d，CCK-8法检测细胞增殖。采用TGF-β1（5.0μg/L）和U0126（10μmol/L）分别单独或联合作用于牙髓细胞7d，CKK-8法检测细胞增殖；在第1、3、5和7天检测碱性磷酸化酶活性；第7天时Western blot检测ERK/MAPK信号通路中的关键蛋白PPAR-γ和ELK-1水平。结果：TGF-β1在牙髓炎组织中低表达，且TGF-β1浓度在0.1～5.0?g/L时，从作用第3天开始能够显著促进牙髓细胞的增殖（P<0.05），具有时间和剂量依赖效应。U0126能够抑制牙髓细胞的增殖和碱性磷酸化酶的活性，具有时间依赖性。TGF-β1能够促进PPAR-γ和ELK-1蛋白的表达，而U0126能够降低TGF-β1对PPAR-γ和ELK-1蛋白表达的促进作用。结论：TGF-β1可以促进牙髓细胞的增殖和分化，且具有时间和浓度依赖效应，其作用机制可能与ERK/MAPK信号通路相关。
[关键词]牙髓细胞；增殖；分化；碱性磷酸化酶；信号通路
[中图分类号]R781.3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0094-04
Effect of TGF-β1 on the Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Cell Based on ERK/MAPK Signaling Pathway
XU Wan-tian，CHEN Yun，LIN Nan，TANG Yu-xiang，YAN Xiang
（The Third Clinic Department，Nanjing Stomatological Hospital Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To study the effects of TGF-β1 on the proliferation， differentiation and ERK/MAPK signaling pathway of human dental pulp cells. Methods We used Western blot to detect TGF-β1 expression in acute and chronic dental pulp tissue organization and normal dental pulp tissue. Primary human dental pulp cells were isolated and cultured by typeⅠcollagenase digestion. Human dental pulp cells were treated by different concentrations of TGF-β1 for 7d. Used CCK-8 method to detect cell proliferation. Human dental pulp cells were treated by TGF-β1 （5.0μg/L） and U0126 （10μmol/L） separately or jointly for 7d and cell proliferation was detected by CKK-8 method. The activity of alkaline phosphorylase was detected in 1d， 3d， 5d and 7d. The levels of key proteins PPAR-γ and ELK-1 in the ERK/MAPK signaling pathway were detected by Western blot. Results TGF-β1 was low expression in the pulpitis tissue， and TGF-β1 concentration at 0.1-5.0μg/L， the proliferation of pulp cells was significantly promoted from the first 3d beginning （P<0.05）， with time and dose dependent effects. U0126 could inhibit the proliferation of pulp cells and the activity of alkaline phosphorylase， which had time dependence. TGF-β1 could promote the expression of PPAR-γ and ELK-1， while U0126 could reduce the promoter action of TGF-β1 on PPAR-γ and ELK-1 protein expression. Conclusion TGF-β1 could promote the proliferation and differentiation of pulp cells， and had time and concentration dependence effect， and its mechanism might be related to ERK/MAPK signaling pathway.
Key words： pulp cells； proliferation； differentiation； alkaline phosphorylase； signaling pathway
研究表明牙髓组织中含有自我增殖和分化的间充质干细胞，当牙髓复合体受到损伤后，牙髓细胞就会向受损部位迁移完成对牙本质的修复和保护[1]。但其调控机制尚不清楚。转化生长因子β1（Transforming growth factor β1， TGF-β1）作为调控牙髓细胞迁移重要因子，参与到了反应性牙本质的修复[2]，有报道[3]称其可以通过p38 MAPK信号调控抑制牙髓细胞增殖。研究表明胞外信号调节激酶/分裂原激活蛋白激酶信号通路（Extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK）能够介导多种细胞的增殖和迁移[4]，而TGF-β1是否能够基于ERK/MAPK信号通路对牙髓细胞增殖和分化进行调控尚未见报道。碱性磷酸化酶（Alkaline phosphorylase， ALP）是一种正磷酸甲酯磷酸水解酶，研究表明其水平高低可以反映牙髓细胞的分化情况[5]。因此本文主要探讨ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞增殖以及分化中的作用，从而为牙髓组织修复提供理论支撑。
1 材料和方法
1.1 一般资料：选取南京大学医学院附属口腔医院保存的急性牙髓炎组织标本、慢性牙髓炎组织标本和正常牙髓组织标本各30例作为研究对象。
1.2 主要仪器和试剂：TGF-β1、ERK/MAPK信号通路阻断剂U0126，采购自Peprotech公司。兔抗PPAR-γ、 ELK-1单克隆抗体自美国Abcam公司采购，酶标仪和流式细胞仪均采购自Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 Western blot检测TGF-β1在牙髓组织中的表达：急性牙髓组织、慢性牙髓组织和正常牙髓组织中蛋白各取100g，裂解蛋白酶进行总蛋白提取。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整浓度，上样进行电泳，结束后4℃转膜，5% BSA封闭2h，加入一抗（羊抗TGF-β1单克隆抗体）、二抗（羊抗鼠IgG）37℃孵育2h，ECL显影后扫描，蛋白相对表达量经内参校正后经Quanity-One软件分析，β-actin作为内参。
1.3.2 人牙髓组织体外培养和传代：征得患者同意后，取在南京大学医学院附属口腔医院就诊年龄18～25岁的因阻生或正畸而拔出的健康牙齿，乙醇消毒，在超净台中取出牙髓组织，然后PBS冲洗，放置于DMEM溶液中并剪成1～2mm3的组织块，加入Ⅰ型胶原酶消化40min，然后低速离心弃上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液，接种于培养瓶中，37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔2d更换一次培养液，细胞铺满瓶底80%左右，加入胰酶进行消化传代，本研究采用第4～5代细胞进行研究。
1.3.3 CCK-8法检测TGF-β1对牙髓细胞增殖能力的影响：取传代一致的牙髓细胞，调整细胞浓度至1×105接种于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，更换无血清DMEM培养基进行饥饿处理24h，然后分别更换成含TGF-β1终浓度为0.1、0.5、2.0、5.0μg/L的DMEM培养基，同时设置只加DMEM的对照组，每隔2d更换一次培养基。然后在培养1、3、5和7d时，每孔加入10μl CCK-8溶液，继续培养4h，酶标仪检测各组OD值。
1.3.4 ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞增殖过程中的作用：实验步骤同1.3.3，共分为4组：①对照组；②TGF-β1（5.0μg/L）处理组；③TGF-β1（5.0μg/L）+U0126（10μmol/L）处理组；④U0126（10μmol/L）处理组。
1.3.5 Western blot检测PPAR-γ、ELK-1蛋白表达：按照1.3.4各组处理培养7d，提取蛋白，按照1.3.1步骤对PPAR-γ、ELK-1蛋白进行检测。
1.3.6 碱性磷酸化酶水平检测：取传代一致的牙髓细胞，调整细胞浓度至1×105接种于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，更换无血清的DMEM培养基进行饥饿处理24h，然后按照1.3.5分组替换含TGF-β1或U0126的培养基，分别在培养的1d、3d、5d和7d时，弃去细胞培养基，加入50μl 1g/L的TrionX-100，4℃过夜，然后每孔加入200μl ALP底物，37℃、5%CO2培养箱中培养30min，加入碱液终止反应，酶标仪检测OD值。
1.3.7 统计学分析：数据分析采用SPSS 16.0软件，绘图采用GraphPad Prism 5.0软件，计量资料采用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 TGF-β1在各牙髓组织中的表达比较：如图1所示，TGF-β1在急性牙髓炎组织和慢性牙髓炎组织中的表达显著低于正常牙髓组织，差异有统计学意义（P<0.05）。
注：A.正常牙髓组织；B.急性牙髓炎组织；C.慢性牙髓炎组织；*表示与正常牙髓组织比较，P<0.05
图1 TGF-β1在各牙髓组织中的表达
2.2 TGF-β1对牙髓组织增殖的影响：如图2所示，在培养第3、5和7天，0.5、2.0、5.0μg/L TGF-β1组细胞中的OD490值均显著高于对照组（P<0.05），且OD490值随着TGF-β1浓度的增加而不断升高。同一浓度下与第1天比较，OD490值在第3、5和7天均显著升高（P<0.05）。本次后续研究选用TGF-β1濃度为5.0μg/L。
注：*表示與对照组比较，P<0.05；△表示与第1天比较，P<0.05
图2 TGF-β1对牙髓组织增殖的影响
2.3 ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞增殖的影响：如图3所示，牙髓细胞培养第3、5和7天，TGF-β1组细胞的OD490值显著高于对照组（P<0.05）；而TGF-β1+U0126组和U0126组的OD490值显著低于对照组和TGF-β1组（P<0.05）。
注：*表示与对照组比较，P<0.05；△表示与TGF-β1组比较，P<0.05
图3 ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞增殖的影响
2.4 ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞分化的影响：如图4所示，牙髓细胞培养第3、5和7天，TGF-β1组细胞ALP活性显著高于对照组（P<0.05），且随着时间的增加，活性逐渐增高。而TGF-β1+U0126组和U0126组的细胞ALP活性显著低于对照组和TGF-β1组（P<0.05）。
注：*表示与对照组比较，P<0.05；△表示与TGF-β1组比较，P<0.05
图4 ERK/MAPK信号通路在TGF-β1调控牙髓细胞分化的影响
2.5 TGF-β1调控牙髓细胞增殖和分化中对PPAR-γ、 ELK-1蛋白表达的影响：如图5所示，TGF-β1组PPAR-γ和ELK-1蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）；而TGF-β1+U0126组和U0126组的PPAR-γ和ELK-1蛋白表达水平显著低于对照组和TGF-β1组（P<0.05）。提示U0126能够降低TGF-β1对PPAR-γ和ELK-1蛋白表达的促进作用。
注：A.对照组；B.TGF-β1组；C.TGF-β1+UO126组；D.UO126组；*表示与对照组比较，P<0.05；△表示与TGF-β1组比较，P<0.05
图5 TGF-β1调控牙髓细胞增殖和分化中对PPAR-γ、ELK-1蛋白表达的影响
3 讨论
牙髓组织作为一种有矿化组织包绕的疏松结缔组织，在牙本质形成、咀嚼和防御方面起着重要的作用，因此其健康与否直接关系到牙齿的形态和功能[6-7]。牙髓受损后，其治疗立足于保存患牙，但是死髓牙要想进行正常的咀嚼功能，仍需要大量的后续修复治疗。因此保存活牙髓，对牙髓复合体组织进行诱导再生，已成为目前口腔科研工作者不断探寻的课题。
近年来研究表明生长因子和牙本质基质成分可以作为始动信号对牙髓进行修复，相关的生长因子譬如骨形成蛋白（Bone morphogenesis proteins， BMPs）、TGF-β1、胰岛素样生长因子等这些都可以在牙本质细胞和牙髓细胞中检测到[3，8-9]。其中TGF-β1研究证实其是细胞增殖、分化和凋亡最重要的调控因子。本研究结果显示TGF-β1在牙髓炎组织中的表达出现下降，随着TGF-β1浓度的升高，处理时间越长，细胞增殖越快。ERK/MAPK作为细胞中重要的信号通路，参与调控细胞增殖、迁移、分化等多种生理过程当中，有文献报道称ERK/MAPK信号通路可以增强牙髓干细胞的增殖和分化[10]。U0126是ERK/MAPK信号通路特异性抑制剂[11]，本研究通过将TGF-β1和U0126分别单独或联合作用于牙髓细胞，结果显示U0126能够抑制TGF-β1对牙髓细胞的增殖作用。本研究还发现TGF-β1能够促进ERK/MAPK信号通路中的关键蛋白PPAR-γ、 ELK-1的表达，提示ERK/MAPK信号通路参与到了TGF-β1诱导的牙髓细胞增殖过程。ALP作为一种正磷酸甲酯磷酸水解酶，其活性的高低可以对细胞的矿化和骨组织形成的状况。在牙髓组织中常将其作为牙髓细胞想牙本质细胞分化的早期标志。本研究结果显示TGF-β1可以显著增加ALP的活性，而U0126降低ALP的活性。
综上所述，TGF-β1可以促进牙髓细胞的增殖和分化，且具有时间和浓度依赖性，其作用机制可能与ERK/MAPK信号通路相关，本研究为牙髓组织修复再生奠定了基础。
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