苦杏仁配方颗粒中苦杏仁苷的测定
王迎春+麻景梅+李斯+李军山+李振江+牛丽颖
摘要：目的 建立苦杏仁配方颗粒中苦杏仁苷的高效液相色谱分析方法及苦杏仁配方颗粒高效液相色谱特征图谱。方法 采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Dionex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92），检测波长为207 nm，流速为0.6 mL/min，进样量10 μL，柱温为30 ℃，测定苦杏仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量，并以苦杏仁苷峰为参照峰分析10批苦杏仁配方颗粒样品，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》进行相似度评价。结果 苦杏仁苷的线性方程为Y=6.176×10-7X-3.058×10-3，在0.122 5～1.225 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为98.75%（RSD=1.30%）。苦杏仁配方颗粒的特征图谱由6个共有峰构成，10批样品的相似度≥0.981。结论 该方法简便、准确、重复性良好，可用于苦杏仁配方颗粒的质量控制。
关键词：苦杏仁配方颗粒；高效液相色谱法；苦杏仁苷；含量测定；特征图谱
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0087-04
Quantitative Analysis of Amygdalin in Kuxingren Formula Granules and Study on Characteristic Chromatogram WANG Ying-chun1，2，3， MA Jing-mei1，2，3， LI Si1， LI Jun-shan2，3，4， LI Zhen-jiang2，3，4， NIU Li-ying1，2，3 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050091， China； 2. Hebei TCM Formula Granule Engineering & Technology Research Center， Shijiazhuang 050091， China； 3. TCM Formula Granule Research Center of Hebei Province University， Shijiazhuang 050091， China； 4. Shineway Pharmaceutical Group Ltd， Shijiazhuang 051430， China）
Abstract： Objective To establish an HPLC analytic method for amygdalin in Kuxingren Formula Granules and HPLC characteristic chromatogram. Methods RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Dionex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （8：92） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 207 nm and sample size was 10 μL. The column temperature was 30 ℃. The peak of amygdalin was set as refernce， and 10 batches of samples were analyzed. TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A） was adopted to evaluate similatity. Results The linear equation of amygdalin was Y=6.176×10-7X?3.058×10-3， with a good linear relationship in the range of 0.122 5–1.225 μg （r= 0.999 8）. The average recovery rate was 98.75% （RSD=1.30%）. There were 6 common peaks in the characteristic chromatogram of Kuxingren Formula Granules， and the similarity of 10 batches of samples was higher than 0.981. Conclusion The HPLC method is simple， accurate and reproducible， which can be used for the quality control of Kuxingren Granules.
Key words： Kuxingren Formula Granules； HPLC； amygdalin； content determination； characteristic chromatogram
Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子，具有降气止咳平喘、润肠通便功效，主要用于治疗咳嗽气喘、胸满痰多、肠燥便秘等[1]。苦杏仁配方颗粒由苦杏仁饮片经提取浓缩制成。为更全面控制苦杏仁配方颗粒的质量，本试验采用高效液相色谱法（HPLC）对苦杏仁配方颗粒中的苦杏仁苷进行定量分析，并建立苦杏仁配方颗粒的特征图谱。
1 仪器与试药
戴安Ultimat3000型高效液相色谱系统（Ultimat3000四元泵，Ultimat3000自动进样器，Ultimat3000二极管阵列检测器，Chrome-leon client色谱工作站），CP225D型电子分析天平（赛多利斯公司），JCX-250G超声清洗机（山东济宁恒盛超声机械有限公司）。
苦杏仁配方颗粒（批号分别为14061106、14062107、14062321、14071121、14072308、14082121、14082321、14091109、14092108、14092311），神威药业集团有限公司；苦杏仁苷对照品（批号110820-201305），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 苦杏仁苷定量分析
2.1 色谱条件
2.2 对照品溶液的制备
精密称取以五氧化二磷干燥24 h的苦杏仁苷对照品10.21 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.021 mg/mL苦杏仁苷储备液；精密量取储备液0.6 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得61.26 μg/mL的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品适量，研细，称取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
精密称取糊精约0.25 g，按“2.3”项下方法制备，即得。
2.5 系统适用性试验
在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液各10 ?L，注入色谱仪，记录色谱图，结果阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
2.7 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，测得苦杏仁苷峰面积，计算得RSD=1.0%，结果表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18 h进样10 μL，测得苦杏仁苷峰面积RSD=1.2%，结果表明供试品溶液在18 h内稳定。
2.9 重复性考察
取同一批样品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算苦杏仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量。结果苦杏仁苷平均含量为61.2 mg/g，RSD=0.80%，表明方法重复性良好。
2.10 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品共9份，分别按样品中苦杏仁苷含量的80%、100%、120%精密加入苦杏仁苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表1。
2.11 样品含量测定
分别取3批样品（批号分别为14091109、14092108、14092311），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，每份供试品溶液重复测定2 次，计算含量，结果见表2。
3 苦杏仁配方颗粒特征图谱的建立
3.1 色谱条件
色谱柱：Dionex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；流速：0.6 mL/min；检测波长：207 nm；柱温：30 ℃，进样体积10 μL，在此色谱条件下，对照品及样品中各色谱峰均得到良好分离[6-10]。
3.2 对照品溶液的制备
取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。
3.3 供试品溶液的制备
取本品适量，研细，称取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4 特征图谱方法学考察
3.4.1 精密度试验 取同一批苦杏仁配方颗粒（批号14091109），按“3.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次。结果各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，均RSD<3%，表明仪器精密度良好。
3.4.2 稳定性试验 取同一苦杏仁配方颗粒供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18 h进样测定。结果各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积无明显差异，均RSD<3%，表明供试品溶液在18 h内稳定。
3.4.3 重复性试验 取同一批苦杏仁配方颗粒（批号14091109）共6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，进行测定。结果各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积无明显变化，均RSD<3%，表明方法重复性良好。
3.5 特征图谱的构建与评价
3.5.1 特征峰的确定 按“3.1”项下色谱条件对10批苦杏仁配方颗粒进行测定，记录色谱图，见图2。可见，色谱峰1～6为10批样品的共有峰，因此确定1～6为苦杏仁配方颗粒的特征峰。其中6号峰确认为苦杏仁苷，该峰面积较大且较稳定，故选择该峰作为参照峰（S）。以苦杏仁苷为参照，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表3、表4。
3.5.2 相似度评价 将10批苦杏仁配方颗粒特征图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》软件，采用多点校正将色谱峰自动匹配，生成对照图谱，进行相似度评价。10批苦杏仁配方颗粒与对照图谱的相似度分别为0.993、0.998、0.981、0.989、0.992、0.987、0.989、0.985、0.994、0.988。10批苦杏仁配方颗粒的特征图谱见图3。
4 讨论
本试验对色谱条件的选择参考了2010年版《中华人民共和国药典》（一部）苦杏仁含量测定项下条件，选择以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）为流动相，207 nm为检测波长，分别考察了1.0、0.8、0.6 mL/min流速下样品的分离效果，结果表明流速为0.6 mL/min时样品中的色谱峰分离度高且峰形对称。
供试品溶液制备方法考察了不同提取溶剂及超声时间对提取效果的影响，分别考察了以水、50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、100%甲醇、100%乙醇为提取溶剂，超声提取10、20、30、40、60 min，结果表明以50%甲醇超处理声30 min提取效果最好，能较完全地将大多数成分提取出来。
苦杏仁苷是苦杏仁药材中的主要活性成分，其水溶性好，以苦杏仁苷作为苦杏仁配方颗粒质量控制指标是合理可行的。以苦杏仁苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，从10批苦杏仁配方颗粒特征图谱分析结果可以看出，各色谱峰相对保留时间比较吻合，相对峰面积波动较小，各批样品的相似度较高，这说明各批次苦杏仁配方颗粒的成分基本相同，且其含量差异不大，均一性较好，表明样品的生成工艺比较稳定。
总之，本试验采用HPLC对苦杏仁配方颗粒中的苦杏仁苷进行了定量分析，同时建立了苦杏仁配方颗粒特征图谱，既考虑了苦杏仁配方颗粒有效成分的含量，又考虑了其特征图谱整体相似度，能较全面地反映苦杏仁配方颗粒的整体质量。本试验所建立的分析方法简便，具有较好的稳定性和重复性，可为苦杏仁配方颗粒的全面质量控制和评价提供参考。
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