...14-16日\"2015版《中国药典》微生物学检验技术实施指导与修订解...

田怀平++王玲++杜毅++唐跃年

摘要：目的 建立符合2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）要求的射干合剂的微生物限度检查方法。方法 采用2015年版《中国药典》方法对射干合剂进行微生物限度检查方法学验证。薄膜过滤法进行样品前处理，使用6种菌株分别进行微生物计数检查和限度菌检查的方法适用性研究。结果 微生物计数检查的5种菌株的回收比值均在0.5～2之间，控制菌检查的大肠埃希菌检出合格。结论 射干合剂的微生物限度检查方法经验证符合2015年版《中国药典》要求。

关键词：射干合剂；微生物计数检查；限度菌检查；薄膜过滤法；中华人民共和国药典

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.017

中图分类号：R927.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0072-04

Study on Applicability of Microbiological Examination Methods for Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015 TIAN Huai-ping， WANG Ling， DU Yi， TANG Yue-nian （Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Abstract： Objective To standardize the method of microbiological examination on Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015. Methods Chinese Pharmacopoeia 2015 was used. Microbial enumeration test and specified microorganisms test were used to verify Shegan Mixture. The samples were treated by membrane filtration. Six kinds of strains for microbiological counting and limiting bacteria were used to study applicability. Results Microbial counts of the five strains of the recovery ratio were between 0.5 to 2， and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion The microbiological examination methods for Shegan Mixture can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia 2015.

Key words： Shegan Mixture； microbial enumeration test； specified microorganisms test； membrane filtration method； Chinese Pharmacopoeia 2015

射干合劑为本院临床应用多年的医院制剂，是著名儿科名家时毓民的经验方，由麻黄（炙）、射干、黄芩、前胡、苦杏仁、僵蚕、蔊菜、蝉蜕、百部（炙）等组成，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的功效，常用于治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎引起的咳嗽、多痰等症状。该制剂委托上海方心制药科技有限公司生产（批准文号：沪药制字Z04180745，执行标准SYZ-ZF-017-2004），常规质量控制检查包括鉴别、装量、含量测定和微生物检查等[1]。

2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）的微生物检查法与2010年版比较，在培养基、培养条件和检验方法等方面有重大改变[2]。现有

基金项目：上海市卫生局中医药科研基金（2012G003A）

通讯作者：唐跃年，E-mail：tyn2018@163.com

制剂的微生物检查方法，应按照新版《中国药典》调整，并进行方法适用性检查，但此类研究报道较少。本试验按照2015年版《中国药典》要求，对射干合剂的微生物限度检查法进行方法适用性验证研究，以期为药品质量控制部门采用新版《中国药典》进行微生物检查和质量分析提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ME204电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；CLG-32L高压蒸汽灭菌锅，日本ALP CO.，Ltd.公司；M017生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；SW-CJ医用型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HTY-APL01集菌仪，杭州泰林生物技术设备有限公司；集菌培养器，型号KSF330，批号20161105，杭州泰林生物技术设备有限公司；PYX-DHS40*50电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；MJ-250I霉菌培养箱，上海一恒科技有限公司；Microflex LT质谱仪，德国布鲁克道尔顿公司。

1.2 药物

射干合剂，本院委托上海方心制药科技有限公司生产的外加工制剂，批号分别为151201、160913、160914，规格100 mL/瓶，有效期限12个月。

1.3 微生物限度标准

射干合剂为非无菌不含药材原粉的中药口服液体制剂。2015年版《中国药典》四部1107微生物限度标准：需氧菌总数不超过102 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌数为200），霉菌和酵母菌总数不超过101 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌数为20）。不得检出大肠埃希菌（1 mL）[2]。endprint

1.4 培养基和稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptic Soy Agar，TSA，批号20160107），沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar Medium，SDA，批号20160126），胰酪大豆胨液体培养基（Trypticase Soytone Broth，TSB，批号20160219），麦康凯液体培养基（MacConkey Broth，Mac B，批号20160902），麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar，Mac A，批号150929）。配制好的培养基采用121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，高压蒸汽灭菌采用3M1292生物指示剂（批号20160428，美国3M公司）验证合格。培养基全部产自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。稀釋液为本院制剂室生产的0.9%无菌氯化钠溶液，质量检查合格。每批次培养基均按照2015年版《中国药典》要求，进行与对照培养基验证试验，适用性检查合格[2]。

1.5 菌种

需氧菌总数使用TSA培养基检查，菌种为金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B） 10104]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，CMCC（B） 63501]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F） 98001]和黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]；霉菌和酵母菌总数使用SDA培养基检查，菌种为白色念珠菌和黑曲霉。控制菌检查使用Mac B和Mac A培养基，试验菌种为大肠埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]。试验菌种均为中国食品药品检定研究院提供的0代菌种，试验前传代至第3代。

2 方法与结果

2.1 试验菌液的制备

按照2015年版《中国药典》四部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（1105）和控制菌检查法（1106）的方法，分别制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和大肠杆菌的菌液[2]。接种的验证菌为传代至第3代的菌种，菌液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，各菌种的稀释倍数在10-6～10-8之间，最终试验组接种量为1 mL含菌50～100 cfu。菌液制备后，室温放置则2 h内使用，若保存在2～8 ℃则24 h内使用。

2.2 供试液的制备

将射干合剂混匀，量取10 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至100 mL，混匀，为1∶10的供试液。量取1∶10供试液10 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至100 mL，混匀，为1∶100供试液。供试液制备后1 h内完成接种。

2.3 微生物计数检查分组

计数检查方法验证时，检品分为4组，每种菌株分别制备加菌试验组和菌液对照组，每种培养基分别制备供试品对照组和阴性对照组。由于射干合剂含多种有抑菌作用中药，因此采用薄膜过滤法消除样品的抗菌活性。①加菌试验组：分别取1∶10供试液和1∶100供试液各10 mL，使用集菌培养器进行薄膜过滤，0.9%无菌氯化钠溶液冲洗3次，每次100 mL，在最后一次的冲洗液中加入50～100 cfu试验菌。②供试品对照组：分别取1∶10供试液和1∶100供试液同上操作，最后一次冲洗液不加菌。③菌液对照组：用稀释液0.9%无菌氯化钠溶液代替供试液，其余同加菌试验组操作，最后一次冲洗液中加入50～100 cfu试验菌。④阴性对照组：用0.9%无菌氯化钠溶液代替供试液，其余同加菌试验组操作，最后一次冲洗液不加菌。

2.4 微生物计数检查回收试验

分别将“2.3”项下1∶10供试液和1∶100供试液的4组滤膜取出，菌面朝上贴于TSA或SDA培养基平板上，不同培养基接种不同菌种，培养条件不同。TSA平板接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌时，33 ℃培养不超过3 d；接种白色念珠菌和黑曲霉时，33 ℃培养不超过5 d。SDA平板接种白色念珠菌和黑曲霉，23 ℃培养不超过5 d。每株试验菌制备2个平皿，取菌落数平均值作为计数培养结果。2种培养基分别进行供试品对照组和阴性对照组计数。3个批号样品进行3次独立平行试验。计算各试验菌的计数检查回收比值。

回收比值=（加菌试验组菌落数-供试品对照组菌落数）÷菌液对照组菌落数。

2.5 微生物控制菌检查

2.5.1 菌液验证组 取“2.2”项下1∶10供试液和1∶100供试液各10 mL，使用集菌培养器进行薄膜过滤，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗3次，每次100 mL，在最后一次的冲洗液中加入50～100 cfu大肠埃希菌。集菌培养器中加入100 mL TSB培养基，33 ℃培养18～24 h。取培养物1 mL，接种至100 mL Mac B培养基中，42 ℃培养24～48 h，取Mac B培养物划线接种于Mac A平板上，33 ℃培养18～72 h，若有菌落生长，使用Microflex LT质谱仪进行分离纯化鉴定，判断是否检出大肠埃希菌。

2.5.2 供试品对照组和阴性对照组 取“2.2”项下1∶10供试液和1∶100供试液，按“2.5.1”项下操作，最后一次冲洗液不加菌，为供试品对照组。用稀释液0.9%无菌氯化钠溶液代替供试液，最后一次冲洗液不加菌，为阴性对照组。这2组同“2.5.1”项下操作，取Mac B培养物划线接种于Mac A平板上，33 ℃培养18～72 h，观察是否有菌落生长。若有菌落生长，进行分离纯化鉴定并排查原因。

若菌液验证组检出大肠埃希菌，供试品对照组和阴性对照组均未检出大肠埃希菌，可认为射干合剂的供试液制备及控制菌检查方法适用性验证合格。endprint

3 结果

3.1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数检查的验证结果

对1∶10供试液和1∶100供试液用薄膜过滤法处理后，进行3个批次的3次独立平行试验，计算各验证菌的计数检查回收比值，结果所有菌种的回收比值均在0.5～2.0范围内。认为1∶10和1∶100稀释法制备供试液计数检查回收比值均合格，适用性验证合格。为简化操作步骤，建议进行1∶10稀释制备供试液即可。结果见表1、表2。

3.2 控制菌检查的验證结果

3个批次的射干合剂，采用1∶10和1∶100稀释制备供试液，经薄膜过滤法处理，菌液验证组均可检出大肠埃希菌，供试品对照组和阴性对照组均未见菌落生长。认为采用1∶10和1∶100供试液制备进行预处理，培养条件和划线培养方法进行控制菌检查，适用性验证均合格。建议1∶10稀释制备供试液即可。结果见表3。

4 讨论

加强中药制剂生产的监督管理和质量控制，是中药制剂的生存和发展基础[3]。微生物检查是药品质量控制的重要内容[4-5]。中药制剂由于成分复杂，对微生物检查造成一定干扰。射干合剂所含8味中药大多有抑菌作用，传统的常规稀释法不能完全消除抑菌组分对微生物检出的干扰，而薄膜过滤法能够更好地去除干扰，消除抗菌活性。

本研究稀释液和冲洗液均采用2015年版《中国药典》许可的0.9%氯化钠灭菌溶液，与之前的蛋白胨溶液比较，获取便利，成本降低。验证结果表明，用薄膜过滤法处理，微生物计数检查验证所有菌种的回收比值均在0.5～2.0范围内，控制菌检查大肠埃希菌合格。

2015年版《中国药典》对微生物限度检查做了较大修订，完善了微生物计数和控制菌检查体系，质量要求和安全性控制更加严格和合理。需氧菌总数采用TSA培养基代替了营养琼脂培养基；霉菌和酵母菌总数采用SDA培养基替代了玫瑰红钠琼脂培养基，更适合样品中微生物的复苏生长，提高了检测灵敏度[6]。控制菌检查选用TSB培养基代替营养肉汤进行预增菌，增加了受伤菌株的复壮培养，可以提高检出率，防止漏检[7]。需氧菌计数检查的验证菌种用铜绿假单胞菌代替2010年版《中国药典》的大肠埃希菌，铜绿假单胞菌的菌落形态稳定，更适合用于需氧菌总数测定的方法验证性研究[6]。

综上，射干合剂的微生物检查方法适用性合格，薄膜过滤法进行处理有效消除了药品组分的抗菌活性，符合2015年版《中国药典》要求，可以为同类药品进行微生物限度检查提供参考。

参考文献：

[1] 朱鹏程，吴敏，唐跃年，等.射干合剂的定性及定量质量控制标准研究[J].中国医药导报，2016，13（12）：20-23.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：136-151.

[3] 张晓萌，刘文娜，裴桂芳.医院中药制剂研发思路与组织管理[J].中国中医药信息杂志，2013，20（7）：8-9.

[4] 胡昌勤.药品微生物控制现状与展望[J].中国药学杂志，2015，50（20）：1747-1751.

[5] 关洪全.控制微生物污染中药材的几点思考[J].中国中医药信息杂志， 2000，7（6）：7-8.

[6] 杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查微生物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36（6）：1101-1107.

[7] 杨晓莉，李辉，马英英，等.《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）：748-752.

（收稿日期：2017-04-19）

（修回日期：2017-05-11；编辑：陈静）endprint